拟威克酵母的烷烃利用、CYP450家族基因的表达和功能研究

作     者：李伟伟 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋欣

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：拟威克酵母 烷烃利用 槐糖脂 细胞色素P450 基因表达 

摘      要：槐糖脂是一种由一些非致病性酵母产生的糖脂类生物表面活性剂。微生物产生的槐糖脂是由一系列的槐糖脂分子组成的混合物,这些混合物可以归结为两类,一类是内酯型槐糖脂,另一类是酸型槐糖脂。其中,内酯型槐糖脂具有更好的抗菌活性和更强的降低表面张力的能力,而酸型槐糖脂则具有更强的发泡能力和更好的水溶性。由于槐糖脂具有低毒性、生物可降解性和良好的环境兼容性等特点,使其能够广泛应用在洗涤剂、化妆品、石油工业和环境保护等诸多领域。拟威克酵母是本实验室从污水中分离得到的高产槐糖脂的菌株,槐糖脂的产量可达130 g/L以上,具有较大的应用潜力。因此,对拟威克酵母槐糖脂合成调控途径中相关基因的深入研究,有助于我们促进槐糖脂在更多工业领域中的应用开发。本论文的主要研究内容和结果如下：1.拟威克酵母对不同碳链烷烃的利用在拟威克酵母的发酵培养基中分别添加不同碳链的烷烃(正辛烷、正癸烷、正十二烷、正十四烷、正十六烷和正十八烷),通过测定添加不同碳链长度的烷烃时槐糖脂的产量和用HPLC-MS分析产物槐糖脂的成分可知：拟威克酵母对正十六烷的利用效果最好,对正十四烷和正十八烷也能较好的利用,但对正辛烷、正癸烷和正十二烷只能微弱地利用;拟威克酵母利用正辛烷、正癸烷、正十二烷、正十四烷和正十六烷产生较多的内酯型槐糖脂,利用正十八烷产生较多的酸型槐糖脂。2.不同碳链烷烃对拟威克酵母CYP450基因的诱导表达通过分析拟威克酵母基因组的测序结果,发现了7个细胞色素P450基因,它们是CYP52-M1、CYP52-N1、CYP52-N2、CYP52-E1、CYP52-E2、CYP51和CYP-X。在发酵培养基中分别添加不同碳链的烷烃(正辛烷、正癸烷、正十二烷、正十四烷、正十六烷和正十八烷),通过对拟威克酵母CYP450基因表达量的测定可知：在烷烃代谢方面,CYP52-M1、CYP52-E1、CYP52-E2、CYP52-N1和CYP51基因起到了较为重要的作用,其中CYP51基因是组成型表达的基因,CYP52-M1、CYP52-E1、 CYP52-E2和CYP52-N1基因是诱导型表达的基因;在烷烃代谢方面,CYP52-N2和CYP-X基因不像其他CYP450基因一样起到较为重要的作用。3.拟威克酵母CYP450家族基因的功能研究成功构建了拟威克酵母的三种CYP450基因的敲除株ΔCYP52-E1、ΔCYP52-E2和ΔCYP52-N2.以油酸为碳源对拟威克酵母野生株和构建的这三个敲除株进行发酵,通过对发酵产物槐糖脂产量的测定和组分的分析,推断CYP52-E1、CYP52-E2和CYP52-N2是CYP52-M1的同工酶。同时,采用原核异源表达和真核异源表达两种方法对拟威克酵母的CYP52-E1和CYP51蛋白进行异源表达,但均未表达成功。对异源表达失败的重组菌中相关基因进行了荧光定量的检测,发现相关基因在重组菌中进行了转录,但是不能诱导出目的蛋白,推测相关基因在翻译时出现了问题,或是蛋白在分泌时出了问题,抑或是这两种蛋白难以异源表达,原因仍在进一步的探索之中。