从线粒体细胞色素b基因和D-LOOP控制区序列差异研究野牦牛和家牦牛的系统进化关系

作     者：刘强 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴敏

授予年度：2005年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071008[理学-发育生物学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：野耗牛 家耗牛 细胞色素b D-LOOP控制区 系统进化 

摘      要：野牦牛是我国青藏高原的特有物种,但多年来有关野牦牛与家牦牛的分类隶 属关系意见不一,从分子水平上分析两者之间的系统进化关系具有重要意义,能 为遗传育种提供可靠的理论依据。 本文根据牛属动物线粒体两端的特征序列,设计特异性引物,采用PCR技术 从野牦牛基因组中扩增出线粒体细胞色素b基因和D—LOOP控制区序列,扩增产 物经过1.0%的琼脂糖凝胶EB电泳、纯化、回收后转化,再应用抗生素筛选法随 机挑取阳性克隆进行PCR检测。鉴定阳性克隆后对重组质粒进行测序。测序结果 采用DNASTAR软件包(DNASTAR Inc,1996)中的MegAlign程序对同源序列进行 排列,并经人工仔细核查。在此基础上,序列输入MEGA2.1软件包中计算不同序 列间的变异位点、简约信息位点数、颠换百分比、转换/颠换比率、序列间的遗 传距离和差异百分比,用MEGA2.1软件基于Kimura 2-parameter距离采用邻近 法(Neighbor—Joining)构建分子系统树,同时也用PHYLIP3.6软件包 (FelSenstein,2001)使用Heuristic功能搜寻最大简约法(Maximum Parsimony) 和最大拟然法(Maximum Likehood)的系统重建。 实验结果显示线粒体细胞色素b基因和D—LooP控制区PCR扩增片段在琼脂 糖凝胶电泳结果中显示出清晰的特异性扩增条带,经连接及转化实验,在LB固 体培养基上长出较多阳性克隆。随机挑菌进行PCR检测,其结果皆为阳性克隆。 说明成功克隆出野牦牛的线粒体细胞色素b基因和D—LooP控制区序列,并将其 重组入原核表达载体。对重组质粒进行测序的结果经 DNASTAR、MEGA2.1、 PHYLIP3.6软件包的不同方法(Neighbor-Joining、Maximum Parsimony、 Maximum Likehood)构建出的分子系统树基本相同。结果表明野牦牛与家牦牛有 着较瘤牛、家牛、白臀野牛、野牛更近的亲源关系,两者都归于牛属,是同一种 的不同亚种。野牦牛是家牦牛的近祖,它们的分歧时间大约在0.42-0.44百万年 前。 本实验结果为野牦牛和家牦牛的系统学研究奠定了分子水平上的基础。