IL-36促进CD4+T细胞IL-9的表达及其在肿瘤免疫应答中作用的研究
作者单位:苏州大学
学位级别:硕士
导师姓名:王雪峰
授予年度:2018年
学科分类:1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
主 题:白细胞介素36(IL-36) CD4+T淋巴细胞 白细胞介素-9(IL-9) 信号转导与转录激活因子6(STAT6) κB抑制蛋白激酶(IKK) 白细胞介素36(IL-36) 肿瘤免疫应答 肿瘤浸润淋巴细胞 CD44
摘 要:第一部分IL-36促进CD4+T细胞IL-9表达及其机制的初步研究【目的】IL-1家族成员IL-36包括IL-36α、β和γ,它们具有共同的受体IL-36R。Th9细胞以分泌IL-9为主要标志,IL-9是Th9细胞抗肿瘤免疫应答的重要构成组分。本部分研究旨在利用IL-36β来激发IL-36/IL-36R信号,分析其能否促进CD4+T淋巴细胞亚群IL-9的表达,并探讨其作用机制。【方法】取小鼠脾脏,制备单细胞悬液,用免疫磁珠纯化CD4+T淋巴细胞,在Th0、Th1、Th2、Th9,Th17和Treg(CD4+Foxp3+)极化条件下,加或不加入IL-36β,经刺激培养后,收集细胞并裂解,抽提RNA,逆转录后使用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测各细胞亚群极化条件下IL-9 m RNA的表达。同时,在IL-4,TGF-β,IL-36β三种细胞因子不同组合刺激培养条件下,收集细胞及培养上清,经ELISA检测各培养条件IL-9蛋白水平的表达,并且经流式细胞术检测各种培养条件下IL-9及Foxp3的表达水平。此外,在STAT6、IKK抑制剂分别存在的情况下,加或不加入IL-36β,通过ELISA检测Th9极化条件下IL-9表达水平的变化。【结果】结果表明,体外培养的CD4+T细胞经IL-36β分别刺激24hr,48hr,72hr,其IL-9的m RNA表达均明显上调;CD4+T细胞在Th9极化条件下,加入IL-36β,IL-9及其转录因子PU.1的m RNA表达水平均明显上调;同时发现IL-36β对IL-9上调作用呈剂量依赖性;与TGF-β或TGF-β联合IL-4组相比,加入IL-36β后经ELISA和流式检测,发现其均能明显促进IL-9在蛋白水平上的表达;此外,流式检测结果表明,IL-36β在上调IL-9表达的同时,抑制了Foxp3的表达;进一步,尚发现STAT6、IKK抑制剂对IL-36β介导的Th9极化条件下IL-9的上调具有明显的抑制作用。【结论】IL-36/IL-36R信号能显著促进CD4+T细胞多种亚群极化条件下IL-9的表达,并上调IL-9转录因子PU.1的表达;IL-36在Th9极化过程中的作用可替代甚至超越经典途径中IL-4的功能;IL-36对Th9/CD4+Foxp3+调节性T细胞间的平衡具有调控作用;IL-36对IL-9表达的促进作用依赖于STAT6和IKK途径。第二部分IL-9在IL-36介导的抗肿瘤免疫应答中作用的初步分析【目的】我们前期的研究表明IL-36能显著促进肿瘤免疫应答、抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠生存期,且IL-36能显著上调CD4+T细胞IL-9表达,但IL-9及Th9细胞在其中的作用尚不清晰。本部分研究旨在利用过表达IL-36γ的肿瘤细胞,构建荷瘤小鼠模型,拟探讨IL-36信号对肿瘤的抑制作用是否部分依赖于IL-9的存在,及IL-9的缺失是否影响到IL-36介导的抗肿瘤免疫应答。【方法】将B16-IL-36γ及对照B16-vec肿瘤细胞分别腹部外侧皮下接种于C57BL/6J WT小鼠及IL-9基因敲除(IL-9 KO)小鼠,构建荷瘤小鼠模型,每2天测量小鼠肿瘤大小及观察小鼠生存状况,绘制小鼠肿瘤生长曲线和生存曲线;16天取各组小鼠肿瘤,经免疫荧光抗体标记和流式细胞术检测,分析各组荷瘤小鼠肿瘤微环境中免疫细胞亚群及细胞因子的变化。【结果】结果表明,IL-36γ显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期,而IL-9的缺失部分抑制了IL-36γ介导的抗肿瘤作用;IL-9缺失后B16-IL-36γ肿瘤浸润的CD45+细胞群体(CD45+TILs)呈下降趋势,但未见统计学差异,CD4+和CD8+T细胞,CD19+B细胞和NK细胞在CD45+TILs中的比例也未见统计学差异性变化;然而对T细胞活化的分析结果表明,CD4+TILs和CD8+TILs细胞活化标志CD44在IL-9缺失的情况下发生了明显下调;此外,IL-9缺失后,IFN-γ在B16-IL-36γ肿瘤浸润的CD8+TILs细胞中的表达呈下降趋势,但无明显的统计学差别,同时CD4+TILs中IFN-γ表达亦无明显差异。【结论】IL-36对肿瘤的抑制效应部分依赖于IL-9的存在;IL-9的缺失虽然对IL-36过表达情况下肿瘤浸润淋巴细胞的比例和构成未造成显著性的影响,但对CD4+TILs和CD8+TILs细胞的活化造成了负面影响,这可能是其参与构成IL-36介导的抗肿瘤作用、而在缺失后又影响到IL-36抗肿瘤的重要机制之一。