树鼩RBP3蛋白T细胞抗原表位的预测及其致葡萄膜炎活性

作     者：高杰 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：潘永全;陈飞兰

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：实验性自身免疫性葡萄膜炎 树鼩RBP3 IRBP T细胞抗原表位 

摘      要：研究背景与目的间质视黄醇结合蛋白(Retinol-binding Protein,RBP),也称为光感受器间维生素A类结合蛋白(Interphotoreceptor Retinoid-binging Protein,IRBP)是主要由视网膜视杆细胞产生和分泌的一种糖蛋白,位于光感受器间基质,发挥转运和释放光感受器和视网膜色素上皮之间的维生素A类的作用。此外,IRBP还具有很强的抗原性和致葡萄膜炎活性。利用IRBP免疫诱导易感性实验动物建立的实验性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental Autoimmune Uveoretinitis,EAU)模型,是研究人自身免疫性葡萄膜炎的主要工具。目前,大部分研究使用异源性的人和或牛的IRBP,如人IRBP、IRBP免疫C57BL/6小鼠;IRBP免疫B10.RⅢ小鼠;人的R14(IRBP)、R16(IRBP)免疫Lewis大鼠,以及牛的IRBP抗原免疫诱导大鼠。IRBP诱导EAU的机制并不完全清楚,但目前研究认为可能的机制是具有免疫优势的多肽片段与抗原提呈细胞上的主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)有较强的亲和力,即IRBP的免疫优势表位结合于抗原提呈细胞上的MHC分子的重要位点上,激活抗原提呈细胞,活化后的抗原提呈细胞可诱导Na?ve T细胞分化为效应性Th1细胞和Th17细胞,随后上述细胞通过产生如IFN-γ和IL-17等炎性细胞因子而引起疾病的发生。近来,树鼩作为灵长类最亲密的近亲,在视觉系统,免疫系统等方面与灵长类具有高度的相似性,并且已成功利用树鼩建立近视、肝炎等疾病模型。并且研究表明,树鼩的MHC-Ⅱ类分子含有人类相应的MHC-Ⅱ类分子。全基因组测序研究报道了树鼩间质视黄醇结合蛋白RBP3(ELW66657.1),但有关其蛋白的T细胞抗原表位以及是否具有潜在的致葡萄膜炎活性树鼩是否可建立EAU模型并未见报道。基于以上背景,我们进行了以下三个方面的研究:(1)通过DNAMAN软件比对分析树鼩RBP3蛋白与人IRBP蛋白、狒狒IRBP,牛IRBP?大鼠IRBP和小鼠IRBP氨基酸序列的同源性;Protean软件预测树鼩RBP3蛋白的T细胞抗原表位;根据预测结果,筛选并合成与诱导经典B10.RⅢ小鼠EAU模型的IRBP具有较高同源性的抗原多肽,并评价其免疫原性和致小鼠葡萄膜炎的活性,以期筛选出具有免疫原性和致萄膜炎活性的树鼩RBP3蛋白抗原多肽;(2)将筛选出的树鼩RBP3多肽片段免疫B10.RⅢ小鼠诱导EAU,与IRBP诱导B10RⅢ小鼠EAU比较,探讨筛选出的树鼩RBP3抗原多肽诱导B10.RⅢ小鼠葡萄膜炎的发生条件、临床表现、病理组织学特征以及免疫表型特征,以期确定出树鼩RBP3诱导的EAU模型特征;(3)筛选并合成与人R14抗原片段具有较高同源性的树鼩RBP3肽段和人R14抗原片段免疫树鼩,初步探讨上述抗原诱导树鼩实验性自身免疫性葡萄膜炎模型发生的条件、临床表现以及病理特征。通过上述研究,以期为建立新型的EAU模型提供基础的理论依据,以及为葡萄膜炎的研究提供一种理想的动物模型。第一部分树鼩RBP3蛋白T细胞抗原表位的预测及其致葡萄膜炎的活性方法采用DNAMAN软件比对分析树鼩RBP3蛋白氨基酸序列与人IRBP、狒狒IRBP、牛IRBP、大鼠IRBP以及小鼠IRBP蛋白氨基酸序列的同源性。利用Protean软件预测并分析树鼩RBP3蛋白的Th细胞抗原优势表位,以及与鼠MHC-Ⅱ类分子相互作用的T细胞抗原位点。根据预测结果合成RBP3肽段,并以100μg RBP3多肽与弗氏完全佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)充分乳化的PBS溶液200μl通过皮下注射于B10.RⅢ小鼠,按照相同的方法用200μl CFA-PBS溶液免疫B10.RⅢ小鼠作为正常对照组。应用裂隙灯显微镜和H&E染色法评价小鼠眼部炎症的临床表现和病理组织学变化,以期评价RBP3多肽致小鼠的葡萄膜炎活性。应用MTT法检测RBP3多肽对炎症高峰期脾脏淋巴细胞的诱导增殖情况,以期评价筛选出的RBP3多肽的免疫原性。结果Blast结果显示,树鼩RBP3与人的IRBP同源性最高(83.50%),然后按大鼠IRBP(82.94%)、狒狒IRBP(82.81%)、小鼠IRBP(82.63%)、牛IRBP(82.23%)依次递减。预测分析结果显示,树鼩RBP3蛋白含有47个Th细胞抗原优势表位,约占整个氨基序列的44%,同时也具有34个与鼠MHC-Ⅱ类分子I区免疫相关抗原结合位点,约占整个氨基酸序列的19%。B10.RⅢ小鼠在免疫10天后开始产生炎症,13天炎症达到高峰,通过裂隙灯显微镜观察发现,小鼠角膜浑浊、睫状充血、虹膜异常色素