纳米药物递送系统的构建及其抗肿瘤活性的研究

作     者：邓智丽 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑鹄志

授予年度：2018年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 070205[理学-凝聚态物理] 08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 0702[理学-物理学] 10[医学] 

主      题：药物递送 细胞的耐药性 溶酶体 靶向治疗 水解酶响应 

摘      要：当今因为癌症而死亡的人越来越多,人们面对癌症的入侵通常也只能感到无能为力。目前,癌症的治疗方法通常基于手术干预、RT、新辅助化疗(ChT)、激素治疗(HT)或分子靶向治疗(MT)。然而,每个癌症个体和患者的身体状况不一样,并且在每一种治疗癌症的方案中,治疗过程中产生的毒副作用也会让患者感到痛苦万分。所以要找到一种既可以抑制癌症的恶化,又对其它正常组织不会产生副作用的方法是一件非常迫切的事。诺贝尔医学奖获得者Christian de Duve报道了一种新的治疗癌症的方法,通过破坏溶酶体膜使得细胞自溶来杀死癌细胞,也就是把溶酶体定义为“自杀包。简而言之,当某种药物进入癌细胞溶酶体内时,在药物的作用下,溶酶体膜的通透性会提高,因此其中的某些特定组织蛋白会从溶酶体释放到细胞质中,就会引起细胞发生凋亡或类似凋亡的途径。此种杀死癌细胞的方法还可以有效的克服癌细胞的耐药性,因此,使用溶酶体作为潜在的治疗靶点已经引起越来越多的关注在纳米材料中,空心介孔二氧化硅纳米材料已经被广泛应用。因为在所有纳米材料中,其具有优异的生物相容性、大表面积、大孔体积和可调节的孔径。此外,空心介孔二氧化硅的表面还可以进一步修饰靶向物质。多巴胺在材料的修饰以及作为搭建空心介孔二氧化硅和靶向物质的桥梁方面具有很大的潜力。靶向物质通常对癌细胞的某个部位具有特定的识别功能,所以利用靶向物质来进行靶向性的治疗已成为当下医学研究中的热点之一。在利用纳米材料载药得到药物递送系统的过程中,大多数抗癌药物的溶解性差和非特异性限制了其在临床上的应用。然而,通过药物结合物制得的纳米药物粒子具有高载药量和被动肿瘤靶向的能力。基于上述内容,本文构建了两种不同的纳米药物递送系统。一是利用空心介孔二氧化硅载上阿霉素并用碳酸氢钠处理,然后在其表面修饰上聚多巴胺后,再进一步连接叶酸,合成具有靶向性的纳米药物递送系统。二是利用酰胺键把两个阿霉素分子结合起来,然后通过超声制成纳米药物粒子。具体内容如下:(1)具有靶向性以及可产生气泡的pH响应型纳米递送系统的构建本文参照课题组之前合成空心介孔二氧化硅(HMSNs)的方法制得了HMSNs,然后载上阿霉素(DOX)并用碳酸氢钠处理(NaHCO)处理,在其表面修饰上聚多巴胺(pDA),再连接上叶酸就制得了本文所需的纳米药物递送系统BGNSs@pDA-FA。首先我们通过透射电子显微镜(TEM)、Zeta电位和制备过程中颜色的变化来表征了材料的成功合成。然后本文通过体外释放实验证实BGNSs和BGNSs@pDA-FA只有在肿瘤内的弱酸性环境下才会释放药物。此外,通过超声成像实验可以观察到,当在pH为7.4的PBS溶液中,材料几乎没有气泡产生。只有在pH为5.0的时候才会产生气泡。但是体外释放和超声成像两者的结果都展现了BGNSs@pDA-FA的药物和气泡的产生都要比BGNSs的少,这是因为其中修饰的pDA阻碍了药物和气泡的产生,但此并不影响材料对细胞的抗癌效果。(2)BGNSs@pDA-FA对细胞MCF-7、MCF-7/ADR和MCF-10A的抑制作用本文采用了三种细胞来考察了BGNSs@pDA-FA对细胞的作用效果,分别是MCF-7、MCF-7/ADR和MCF-10A细胞。分别采用了体外细胞毒性实验、荧光共定位(CLSM)、溶酶体膜通透性实验(LMP)、Caspase-3酶活性实验、叶酸竞争实验和乳酸脱氢酶实验来研究BGNSs@pDA-FA的作用机制。体外细胞毒性实验表明BGNSs@pDA-FA表现出更好的抗癌效果,并且对正常组织的副作用也较小。CLSM实验验证了本文材料大多数进入了溶酶体,也有少数进入细胞质,这是因为材料进入溶酶体后,气泡的产生提高了溶酶体膜的通透性,伴随释放出的药物就会从溶酶体中进入细胞质。LMP实验证实到BGNSs@pDA-FA确实产生了气泡,并提高了LMP。此外为了验证本文材料是通过什么方式引起癌细胞死亡的,通过实施的Caspase-3酶活性实验和乳酸脱氢酶实验验证到:BGNSs@pDA-FA引起癌细胞死亡是通过凋亡或类似凋亡的途径,不是通过细胞坏死这一途径。叶酸竞争实验表征了BGNSs@pDA-FA中叶酸的成功连接,并且BGNSs@pDA-FA对癌细胞表面的叶酸受体起到了表达作用。综上所述,BGNSs@pDA-FA起到了更佳的抗癌作用。(3)基于酰胺键连接的药物递送系统的构建及其抗癌研究本文通过把两个阿霉素通过酰胺键连接在一起,然后通过超声处理制得药物结合的纳米材料DCD,在溶酶体内酰胺酶的存在下,酰胺键会断裂从而释放出DOX。相比于游离的DOX,其具有可控释放的特性和更好的抗癌效果而对正常组织的副作用较小。本文通过TEM、荧光光谱、动态光散射(DLS)、质谱、氢谱和碳谱表征了DCD的成功合成。DCD对细胞的毒性实验证实到:与MCF