荧光假单胞菌工程菌环境释放后的分子生态学分析和安全性评价

作     者：周琳 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李国勋;张杰

授予年度：2006年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：生态安全性 微生物分子生态学 荧光假单胞菌工程菌 变性梯度凝胶电泳 聚类分析 

摘      要：本研究中通过比较四种土壤样品总DNA的提取方法,确定了以提取成本较低、提取效率较高(3.15 mg DNA/g土)、提取质量最适于偶联后续DGGE技术的土壤样品总DNA的提取方法作为本研究中土总DNA的提取方法:即土壤样品预处理,土壤样品总DNA的粗提取,土壤样品总DNA的纯化;然后以纯化后的土壤总DNA为模板进行细菌16S rDNAV3区扩增;接下来采用微生物分子生态学手段的变性梯度凝胶电泳技术(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)结合DGGE图谱直接观察法和DGGE图谱聚类分析的方法对荧光假单胞菌工程菌株BioP8和分别在基因组和质粒上带有红色荧光蛋白标记(rfp)的荧光假单胞菌8 P303和12P303在进入土壤中后的微生态行为进行了跟踪监测和分析。研究中未发现荧光假单胞菌工程菌株BioP8和分别在基因组和质粒上带有红色荧光蛋白标记(rfp)的荧光假单胞菌8 P303和12P303对土壤中细菌群落组成和结构产生明显的可检测得到的影响。从DGGE图谱上几乎观察不到空白对照土壤样品与喷施了相应菌液的土壤样品有差别;结合ImageJ,Mathworks Matlab V7.1以及PAST软件对DGGE图谱进行聚类分析:在喷施了荧光假单胞菌工程菌株BioP8的处理土壤的DGGE图谱上,第7天、第15天和第45天的空白对照土壤样品和经荧光假单胞菌工程菌BioP8处理的土壤样品分别聚在一起,细菌群落组成相似性大约在88%左右;而第0天与第1天的4份土壤样品聚在一起,第30天与第45天的4份土壤样品聚在一起,第60天与第90天的4份土壤样品聚在一起。由此可以看出,取样时间相对应的空白对照土壤样品与喷施了荧光假单胞菌工程菌BioP8的土壤样品细菌群落组成相似性在85%左右;而纵向时间上的差别也不是很大,其相似性程度也在70%以上;在8 P303的处理的DGGE图谱上,主要有三个cluster:第一个cluster主要包括第0天到第15天的空白对照土壤样品和喷施了基因组带有红色荧光蛋白标记的荧光假单胞菌8 P303的土壤样品,各个样品之间的细菌群落组成相似性均在80%左右;第二个cluster主要包括第30天和第45天的土壤样品,其细菌群落组成相似性在90%左右;第三个cluster主要包括第60天和第90天的土壤样品,其细菌群落组成相似性在80%左右,所有土壤样品细菌群落组成相似性也可达到60%以上;在12P303的处理的DGGE图谱上,第0天到第15天的包括空白对照土壤样品和喷施了带有红色荧光蛋白质粒标记的荧光假单胞菌12P303的土壤样品均聚在一起,细菌群落组成相似性约为80%;第30天和第45天的样品聚在一起,细菌群落组成相似性约为85%;第60天和第90天的样品聚在一起,细菌群落组成相似性也达到80%。由此可见,对于荧光假单胞菌工程菌以及带有红色荧光蛋白标记的荧光假单胞菌,从微生物分子生态学角度评价,二者均具有良好的生态安全性,可以进行大规模的环境释放和田间应用。本研究采用微生物分子生态学手段为荧光假单胞菌工程菌的产业化和生产应用提供直接的科学依据,具有重要的理论意义和实践价值。