甲基强的松龙与促红细胞生成素联合应用对原代星形胶质细胞作用的研究

作     者：郝彦明 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐又佳

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：星形胶质细胞 原代培养 鉴定 形态变化 星形胶质细胞 原代培养 鉴定 损伤 形态变化 甲基强的松龙 促红细胞生成素 星形胶质细胞 缺营养 联合用药 保护 

摘      要：第一部分原代星形胶质细胞模型制作及鉴定 目的通过新生鼠大脑制作原代星形胶质细胞,并进行鉴定和星形胶质细胞纯度测定 方法采用出生三天内的SD大鼠大脑制成细胞悬浊液后,按1.5×107计数接种于已用0.01%多聚赖氨酸包被好的底面积为75cm2培养瓶中,放置于培养箱中(5%CO2,95%O2,37OC)培养,采用含15%的胎牛血清的DMEM培养液培养7d,通过摇床和逐渐传代纯化星形胶质细胞,观察细胞的变化,通过免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞。 结果通过摇床与高血清培养可获得高纯度星形胶质细胞,并随逐渐传代更加纯化,形态也逐渐变化,培养的细胞GFAP染色呈阳性,显示正常星形胶质细胞胞体呈多角形,胞膜光滑,边界清楚,突触长且多相互连接,GFAP阳性细胞占总细胞数比例在95%以上。 结论通过新生鼠大脑制作原代星形胶质细胞,高血清培养基和摇床后培养可获得高纯度的星形胶质细胞。 第二部分原代星形胶质细胞缺营养损伤模型制作 目的制作理想的原代星形胶质细胞的损伤模型,观察形态变化 方法采用出生三天内的SD大鼠大脑制成细胞悬浊液后,采用含15%的胎牛血清的DMEM培养液培养,通过摇床和逐渐传代纯化星形胶质细胞。采用PBS缓冲液代替培养基模拟缺营养模型,缺营养3h后恢复营养,观察细胞缺营养前后形态变化。 结果缺营养3h后部分细胞胞体变小,突触变短,细胞间相互连接减少或消失,个别细胞呈圆形,复营养后大多数细胞胞体变大,突出变长并相互交错,基本恢复缺营前形态,个别细胞死亡成圆形。结论高血清培养和摇床后可获得高纯度的星形胶质细胞,原代星形胶质细胞可耐受一定的缺营养损伤,恢复营养后可基本恢复至损伤前的形态 第三部分甲基强的松龙与促红细胞生成素联合应用对原代星形胶质细胞作用的研究 目的研究甲基强的松龙(MPSS)与促红细胞生成素(EPO)单独以及联合应用对体外培养的原代星形胶质细胞的作用。 方法采用出生3d内的SD大鼠大脑制成细胞悬浊液,采用含15%的胎牛血清的DMEM培养液培养,通过摇床和逐渐传代纯化星形胶质细胞,按1.5×107计数接种于已用0.01%多聚赖氨酸包被好的底面积为75cm2培养瓶中,放置于培养箱中(5%CO2,95%O2,37OC)培养,通过摇床和逐渐传代纯化星形胶质细胞,实验分为正常组、正常+ MPSS组、正常+EPO组、正常+ MPSS+EPO组、损伤组、损伤+ MPSS组、损伤+EPO组、损伤+ MPSS+EPO组。通过PBS缓冲液代替培养基模拟缺营养模型3小时后即刻分别加入甲基强的松龙(10umol/l)、促红细胞生成素(10u/l)、甲基强的松龙(10umol/l)与促红细胞生成素(10u/l),然后分别继续培养三天,免疫荧光技术鉴定星形胶质细胞;MTT法检测细胞的增殖活性和凋亡;PCR技术测定细胞GFAP RNA表达的变化。 结果星形胶质细胞摇床后传至第三代,经鉴定星形胶质细胞纯度达95%以上;缺营养3h后部分细胞胞体变小,突触变短,细胞间相互连接减少或消失,个别细胞呈圆形,复营养后大多数细胞胞体变大,突出变长并相互交错,基本恢复缺营前形态,个别细胞死亡成圆形;正常组和损伤组分别加入MPSS、EPO、MPSS和EPO三天后,损伤组细胞活性与GFAP表达均明显升高,并且联合应用MPSS与EPO与单独应用MPSS、EPO相比,细胞活性与GFAP表达明显升高,但是正常组没有明显变化。 结论适当剂量的MPSS与EPO联合应用对缺营养损伤的星形胶质细胞有显著的保护作用,并且与单独应用MPSS、EPO相比有显著性作用,而MPSS、EPO单独应用,MPSS与EPO联合应用对正常的星形胶质细胞均无显著性保护作用。