重组人白蛋白融合干扰素在毕赤酵母中的表达及稳定性研究

作     者：张伍魁 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋礼华;范清林

授予年度：2006年

学科分类：0710[理学-生物学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 100102[医学-免疫学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

主      题：电转化 白蛋白融合α-2b干扰素 Mut表型 Wish细胞-VSV病毒系统 酶联免疫吸附法 

摘      要：目的 用电转化方法将线性化重组表达载体质粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b转化整合入毕赤酵母宿主菌SMD1168，甲醇诱导表达出具有生物活性的目的蛋白，并对转化子表达条件及遗传稳定性进行初步研究。方法 提取重组表达质粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b，小量限制性内切酶双酶切鉴定，鉴定后的重组质粒进行限制性内切酶Sal Ⅰ酶切线性化，纯化经单酶切线性化的重组表达质粒DNA并电转化巴斯德毕赤酵母菌(***)SMD1168。将阳性转化子进行PCR鉴定和Mut表型鉴定并用甲醇诱导表达，将表达上清进行Western-Blot鉴定，抗G418抗性鉴定及用酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合干扰素的表达水平。Wish细胞-VSV病毒系统的细胞病变抑制法(CPE)测定表达蛋白的抗病毒活性及其效价。在摇瓶培养条件下，初步研究了甲醇诱导浓度及菌体诱导起始OD值两因素对转化子表达水平的影响。最后，对转化子基因及表达水平的遗传稳定性进行鉴定。结果 通过电转化方法成功将酶切线性化重组表达质粒DNA整合入宿主菌基因组，并在甲醇诱导条件下成功表达出具有生物学活性的目的蛋白。用酶联免疫法(ELISA)及Wish细胞-VSV病毒系统对目的蛋白的表达水平及抗病毒活性进行了测定，表达量和比活分别是300mg／L和1.1×10IU／mg。摇瓶条件下，通过对甲醇诱导浓度及诱导起始OD值两因素对转化子表达水平的影响的初步研究，我们发现：在0.5％～4.0％的范围，随着甲醇诱导浓度的升高蛋白表达量也升高，在其他因素固定时，菌体诱导起始OD值在5～80的范围内，随着OD值的升高表达量反而下降。同时，整合入转化子的基因还具有遗传稳定性。结论 酶切线性化重组表达质粒DNA的成功整合入宿主菌基因组及目的蛋白的成功表达和基因的表达遗传稳定性研究为大规模的发酵罐表达提供了保证。摇瓶条件下对转化子表达水平影响因素的研