鱼类CYP450酶与有机磷杀虫剂相互作用研究

作     者：边文杰 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李少南

授予年度：2011年

学科分类：07[理学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：对硫磷 毒死蜱 马拉硫磷 细胞色素P450 鱼 

摘      要：细胞色素P450是一类能与CO结合,在450 nm附近有最大吸收峰的血红素蛋白。它广泛分布于动物、植物和微生物体内,它不仅能够催化一些具有重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸、萜类化合物等的生物合成代谢,而且参与许多外源性物质,如除草剂、杀虫剂、药物、环境污染物等的生物氧化。CYP450酶系作用的药物生物转化是药物代谢的重要环节,同时许多药物又对CYP450酶系活性有抑制或诱导作用。本研究拟以3种有机磷杀虫剂对硫磷、马拉硫磷和毒死蜱作为供试药剂,以4种淡水鱼斑马鱼、剑尾鱼、麦穗鱼及太阳鱼作为供试鱼类,以微粒体作为载体,研究了农药对鱼的急性毒性、鱼类种间CYP450介导的对有机磷杀虫剂的氧化代谢、有机磷杀虫剂对鱼类种间CYP450酶系的影响及其相互关系,为农药生态安全性评价提供科学依据。具体研究内容如下： 对硫磷、毒死蜱及马拉硫磷对斑马鱼、剑尾鱼、麦穗鱼及太阳鱼的急性毒性试验。结果表明,对硫磷对四种鱼的96h半数致死量分别为：2.60,0.0559,1.78,1.02mg/L;毒死蜱为1.94,0.171,0.0273,0.0681mg/L;马拉硫磷为7.07,0.907,6.03,0.172mg/L。 用色谱法测定了四种鱼细胞色素P450酶系对三种农药的脱硫代谢产物生产量,并对它们进行了比较研究。结果表明,四种鱼细胞色素P450酶系对对硫磷的代谢能力大小为剑尾鱼太阳鱼麦穗鱼斑马鱼;反映其代谢能力的Vmax/Km值与对硫磷对四种鱼的LC50呈线性负相关,其相关方程为Y=-196710X+561808,R2=0.8635。四种鱼细胞色素P450酶系对毒死蜱的代谢能力大小为麦穗鱼太阳鱼剑尾鱼斑马鱼;反映其代谢能力的Vmax/Km值与毒死蜱对四种鱼的LC50呈线性负相关,但不显著,其相关方程为Y=-35406X+99130,R2=0.3854。四种鱼细胞色素P450酶系对马拉硫磷的代谢能力大小为太阳鱼剑尾鱼斑马鱼麦穗鱼;反映其代谢能力的Vmax/Km值与马拉硫磷对四种鱼的LC50呈线性负相关,其相关方程为Y=-7241.3X+66969,R2=0.9845。由此可知细胞色素P450酶系对三种有机磷杀虫剂的氧化脱硫代谢差异,从而在一定程度上导致了鱼类对农药的耐药性差异。 用生物化学法和紫外分光光度法检测了四种鱼P450酶系的含量或活性。结果表明,斑马鱼细胞色素P450酶含量为0,309±0.037nmol/mg, NADPH-细胞色素C还原酶(NCCR)活性为2.214±0.165nmol/min/mg,氨基比林-N-脱甲基酶(APND)活性为1.082±0.284nmol/min/mg,红霉素-N-脱甲基酶(ERND)活性为2.226±0.140nmol/min/mg,苯胺-4-羟化酶(AH)活性为0.075±0.007 nmol/min/mg。剑尾鱼P450酶系含量或活性依次为0.415±0.032nmol/mg,10.217±1.772nmol/min/mg,2.461±0.094 nmol/min/mg,3.972±0.394nmol/min/mg,0.114±0.010nmol/min/mg。麦穗鱼依次为0.316±0.042nmol/mg,1.921±0.179nmol/min/mg,1.820±0.237nmol/min/mg, 1.725±0.214nmol/min/mg,0.041±0.013nmol/min/mg.太阳鱼依次为0.378±0.030nmol/mg,5.147±0.767nmol/min/mg,1.468±0.408nmol/min/mg,2.114±0.025 nmol/min/mg,0.086±0.013nmol/min/mg.从实验结果可以看出,本试验采用的Bradford法测定蛋白含量、紫外分光光度法测定P450酶系活性,方法灵敏可靠,重复性较好。 以对硫磷、毒死蜱及马拉硫磷为试验药物,研究了其对四种鱼细胞色素P450酶系的影响。结果表明,三种农药对四种鱼的P450含量、NCCR活性、PND活性、ERND活性没有显著的诱导或抑制效应(P0.05),对AH活性有显著影响(P0.05)。