化学法诱导BMSCs向神经元样细胞分化后MET相关基因表达量的变化

作     者：张嘉程 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邢莹

授予年度：2014年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071006[理学-神经生物学] 

主      题：骨髓间充质干细胞 化学诱导法 间质-上皮转化 上皮-间质转化 

摘      要：背景介绍 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是Friedenstein等在1987年首次发现。随后的研究发现,间充质干细胞广泛存在于脐带血、骨髓,甚至外周循环血等,按照来源分类属于间充质细胞,是由原肠胚期的中胚层细胞分化发育形成的。由于此类干细胞在体内外保持相对无限的增殖能力,也易于进行体外的培养和纯化,并且可以在化学试剂或者细胞因子的刺激下分化为多种间质细胞类型,或者分化为神经样细胞。因此BMSCs被公认为基础研究和临床治疗的一种优秀的干细胞源。 间质-上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition, MET)及其逆向过程上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是生物体在生理和病理状态下普遍存在的现象。目前认为MET和EMT大体上可归为三个范畴：(1)胚胎发育的原肠胚形成;(2)创伤愈合与纤维化;(3)癌细胞的病理发生。 不仅细胞形态发生改变,而且细胞的蛋白组成、转录因子和基因表达等诸多特性都发生了变化。发生改变的分子包括：E-钙粘蛋白(E-cadherin)、 N-cadherin、Vimentin、生长因子TGF-β、EGF,转录调节因子Snail、Slug、ZEB1和ZEB2等,对于判断EMT/MET的发生及探讨其机制也具有重要意义。 目前研究表明Wnt/β-catenin信号参与生理和病理的EMT/MET的调节过程。在肾小管发育中,敲除Wnt4a基因可有效阻断间质干细胞迁移和组织局部肾小管上皮细胞的形成。采用基因敲减的方法干扰Wnt/β-catenin通路对于EMT介导的肿瘤发生也有有效的逆转作用。 具有间质特性的BMSCs在化学诱导剂作用下,分化为上皮特质的神经元样细胞,是否具有与其它MET过程相似的基因表达变化、细胞增殖特性变化和类似的分子机制,这一问题尚未见报道。 本实验室已采用化学诱导剂成功诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞的分化,并证明分化细胞表达神经元／神经干细胞的特异性标志蛋白NSE, nestin等,且初具神经元的电生理学特征。阐明BMSCs向神经元样细胞分化中MET相关分子的变化,将有助于深入探讨MET/EMT的分子机制,为研究MET/EMT相关的疾病病理(如肿瘤发生等)提供思路。同时,基于BMSCs体外培养和研究的便利性,或能成为体外研究MET/EMT的细胞工具。 目的 本实验拟采用大鼠BMSCs (P3-P5)经化学试剂DMSO/BHA联合诱导其转化为神经元样细胞,用RT-PCR方法分别检测诱导前后细胞表面蛋白(E-cadherin、N-cadherin等)表达量的变化,以及MET相关分子Slug、Snail、 ZEB1、ZEB2、vimintin、Twist等的基因表达的变化。同时,采用流式细胞仪检测并比较上述诱导前后细胞周期,比较细胞增殖特性。为了探索BMSCs向神经元样细胞分化过程中Wnt/β-catenin信号是否参与MET的调控,我们还将检测通路的相关分子C-myc、Axin2、β-catenin等的基因表达变化。 方法 ***大鼠股骨骨髓提取。取出生4-6周内,体重在100-120g之间的雄性SD大鼠颈锥脱臼处死,75%酒精中消毒后,在无菌条件下剥离大鼠股骨,剪去两侧,用DMEM/F12培养基分别从两端切口冲洗骨髓腔,收集所有细胞至培养皿中,离心以及PBS洗涤后,接种至无菌的培养瓶中(P0),37℃恒温,5%C02以及饱和湿度条件下培养。 2. BMSC的纯化培养。首先,在PO细胞培养24h后,更换新鲜培养基,并弃去未贴壁细胞。当P0细胞生长至大约覆盖培养瓶底部60%-70%时,按照1：2的比例进行细胞传代,使用P3代以后的细胞(呈现高度的细胞形态的均一性和高度的增殖特性)进行下述实验。 3.化学诱导法诱导BMSCs细胞向神经元样细胞分化。取第4代左右(P3-P5)的BMSCs细胞,诱导组使用诱导培养液(10%FBS的DMEM-F12培养基,含bFGF10ng/ml,),对照组(非诱导组)使用完全培养基,培养24小时。之后,诱导组弃去预诱导培养液,加入含BHA200μmol/L和2%DMSO的DMEM-F12培养液进行化学诱导。对照组更换等量的完全培养基。持续观察细胞形态变化。视细胞分化情况4-6h内终止诱导。 ***相关分子的表达量变化的检测。采用总RNA提取试剂盒分别提取实验组和对照组的RNA, Nanodrop精确测定浓度,并以相同量的RNA反转录为cDNA,采用相对定量PCR法检测MET相关分子E-cadherin, N-cadherin、 Slug、Snail、ZEB1、ZEB2、viminti、Twist等蛋白在诱导前后的BMSCs