高效降解菌DNB-S1代谢邻苯二甲酸二丁酯机制研究

作     者：常琴 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闫立龙

授予年度：2017年

学科分类：082803[工学-农业生物环境与能源工程] 07[理学] 08[工学] 0828[工学-农业工程] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：DBP降解菌 DBP 代谢组学 差异代谢物 代谢途径 

摘      要：邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是一类具有“三致毒性的难降解的有机芳香污染物。DBP作为塑化剂常被用于各种工农业生产活动中。目前已经有证据表明,DBP能够对人体,动物,植物,微生物产生毒害作用,而残存于环境中的DBP也可以通过食物网富集,最终影响人类的健康。因此,对于DBP的环境修复的研究刻不容缓。DBP的自然条件下的光解与水解发生都比较缓慢,目前DBP的降解主要靠环境中的微生物完成。但大多数功能微生物在降解DBP的过程中有可能会产生有毒的中间产物,或者一些微生物并不能完全降解DBP,它们在将DBP降解为邻苯二甲酸之后停止,而邻苯二甲酸也是一种环境污染物。所以,对具有降解能力的菌株,研究它的代谢产物和降解DBP的代谢过程是极具环境修复价值。本试验以一株具有高效降解DBP能力的假单胞菌属细菌DNB-S1为研究对象,分别研究该功能菌在两种不同的碳源DBP(500mg/L)和葡萄糖(6g/L)存在的无机盐液体培养基中进行培养时代谢产物的变化。在24h时采集代谢物,并用LC-MS/MS技术对其代谢物进行分析,比较不同碳源存在条件下功能菌株代谢DBP途径的差异,采用代谢组学分析试验得到DBP降解等信息,进一步对DNB-S1菌株代谢DBP的代谢机制进行研究,并探究DBP降解菌对不同浓度中间代谢产物的应答。经过试验和数据分析,获得了以下结果:经过HPLC-MS/MS检测,质谱下机数据中共鉴定到离子12689个。经过T检验分析,差异倍数分析,共筛选出1329个差异离子,这些差异离子即表现出差异的代谢产物。其中上调差异代谢物970个,下调差异代谢物359个。对这些代谢物的类别进行归类分析发现它们大多为芳香化合物和脂类化合物。具体类别有苯环型化合物,脂质及类脂质分子,含有杂环的有机氧化合物,有机氧化合物,以及苯丙素类和聚酮化合物等。在这些差异代谢物中,有毒的中间代谢产物仅有3个,其中包括邻苯二甲酸,可以确定为菌株降解DBP时所产生。通过KEGG代谢路径对比,这些差异代谢物主要参与的代谢通路集中在微生物在不同环境中的代谢通路和次生代谢产物生物合成通路等。具体的,在这些差异代谢产物中,参与氨基糖与核苷酸糖代谢的12个,淀粉蔗糖代谢的10个,糖酵解途径4个,碳代谢途径6个,且这些差异代谢物大多属于内源性化合物。通过KEGG数据库比对,找到了关于DBP降解途径的重要中间产物:邻苯二甲酸,水杨酸,4-羟基苯甲酸,粘糠酸等。可以确定DNB-S1菌株不仅具有高效降解DBP的能力,也具有完全矿化DBP,将DBP降解为CO2和H2O的能力。而DNB-S1菌株对于DBP的开环裂解途径应为原儿茶酸途径和龙胆酸途径。用2m M的龙胆酸,邻苯二甲酸,原儿茶酸及正丁醇分别作为唯一碳源培养DNB-S1菌株,发现菌株DNB-S1并不能直接利用龙胆酸,邻苯二甲酸,原儿茶酸,正丁醇作为唯一碳源生长。分别用不同浓度的龙胆酸,原儿茶酸及正丁醇培养菌株,探究这三种不同浓度的中间产物对于菌株DNB-S1生长能力以及DBP降解率的影响发现:浓度为1、3m M的龙胆酸会促进DNB-S1菌株生长,而用浓度为5mM的龙胆酸培养菌株,菌株在摇瓶试验的第48h开始生长。原儿茶酸与龙胆酸表现出相似的趋势。而正丁醇会降低菌株的生长量与降解率。DNB-S1菌株,作为一株DBP高效降解菌,它可以通过龙胆酸途径及原儿茶酸途径降解DBP,并且能够完全矿化DBP,生成二氧化碳和水。这使得DNB-S1菌株极具修复DBP污染环境的价值,因此,对功能菌株的DBP代谢调控的研究具有深远意义。