纳米羟基磷灰石基因载体的表面修饰及其转染研究

作     者：陈哲东 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：袁铁锤;黄苏萍

授予年度：2011年

学科分类：07[理学] 070205[理学-凝聚态物理] 08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 0702[理学-物理学] 

主      题：纳米羟基磷灰石 聚乙烯亚胺 六偏磷酸钠 牛血清蛋白 人血白蛋白 分散稳定性 基因转染 

摘      要：纳米羟基磷灰石（HAP）作为基因载体有很多优良的特性,但是目前对纳米羟基磷灰石基因载体的应用还存在很多阻碍,目前关键的问题是提高纳米羟基磷灰石的分散稳定性及其携带基因、转染基因的能力。本实验分别采用聚乙烯亚胺（PEI）、六偏磷酸钠、牛血清蛋白、人血白蛋白作为分散剂,采用超声分散和机械搅拌法制备HAP胶体,并利用紫外分光光度计、红外光谱仪、纳米粒度及Zeta电位仪、电子显微镜等手段检测胶体性能,并研究了PEI修饰的不同形貌HAP的生物相容性、细胞毒性和基因转染效率的实验。得到以下主要结论： 对HAP/PEI分散体系进行分析发现当PEI浓度为4‰时,体系具有较好的稳定性;适度的酸性环境有利于体系的稳定性。测试分析表明：PEI在HAP颗粒表面有吸附,PEI的正电荷和高分子链使得HAP颗粒因静电斥力与空间位阻共同作用而分散;TEM下观察发现改性后的纳米羟基磷灰石分散性得到明显改善。 六偏磷酸钠对体系的分散稳定性有较好的效果。实验分析发现：当六偏磷酸钠的浓度为4%、pH为9.5时效果最好;吸附在颗粒表面的六偏磷酸钠为HAP颗粒提供了很高的电位,使得颗粒之间以静电斥力而分散;TEM分析结果显示改性后的纳米羟基磷灰石分散性显著提高。 HAP/牛血清蛋白分散体系的检测发现：中性环境中,牛血清蛋白浓度为2.0mg/ml时分散体系的稳定性相对较好;电位与粒度测试说明牛血清蛋白对纳米羟基磷灰石胶体稳定性的改善是静电斥力与空间位阻共同作用;TEM分析结果表明表面吸附牛血清蛋白的纳米羟基磷灰石颗粒分散性得到一定增强。 人血白蛋白与牛血清蛋白有较为相似的结果：人血白蛋白浓度为2.0mg/ml、pH=7.4时分散体系的稳定性最好;Zeta电位与粒度分析阐述了人血白蛋白浓度和体系pH值对HAP颗粒的影响趋势,红外光谱也显示纳米羟基磷灰石被人血白蛋白吸附修饰,TEM显示出了HAP颗粒较好的分散状态。 经过PEI修饰后各种形貌的HAP均能高效地负载DNA,环境酸碱性的变化亦不会降低HAP对DNA的吸附性。在保护试验中发现：HAP基因载体能有效地保护DNA分子免受分解酶的干扰;较低浓度的PEI修饰剂和低浓度的载体对细胞的毒性不会产生太大的影响;本实验中制备的HAP能将目标基因有效地转染进Hela细胞和CNE-1细胞中,转染效率分别为20%和35%。