水禽呼肠孤病毒P18蛋白鉴定及其反向遗传操作平台的建立

作     者：吴巧梅 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：陈宗艳

授予年度：2017年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：水禽呼肠孤病毒 反向遗传操作系统 P18蛋白 功能鉴定 

摘      要：呼肠孤病毒(Reovirus)在20世纪60年代初期从人和动物的呼吸道或肠道中分离出来,宿主范围广泛,能感染人、脊椎动物、昆虫、植物、真菌等。禽呼肠孤病毒可以感染鸡、火鸡、鸽子、鸭等各种禽类,其中感染水禽的呼肠孤病毒主要包括番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鹅呼肠孤病毒(GRV),鸭呼肠孤病毒(DRV)。近几年,鸭呼肠孤病毒新毒株在水禽养殖业中不断被分离,目前已经成为危害水禽养殖业的最主要的危害因素之一。DRV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)正呼肠孤病毒属成员,病毒粒子呈二十面体对称结构,无囊膜,直径约为60～80nm,核酸序列为10个双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)节段组成,按照核苷酸序列长度分为3组:长基因节段(L1、L2、L3),中基因节段(M1、M2、M3)和小基因节段(S1、S2、S3、S4)。经预测,DRV S1基因节段可能包含3个部分重叠的开放读码框(opening reading frame,ORF),依次编码P10蛋白,P18蛋白和σC蛋白。DRV P18蛋白可能是由146个氨基酸组成的非结构蛋白,分子量大小约为18 kDa,经典MDRV对应的S4基因节段只编码P10蛋白和σC蛋白,ARV的P17蛋白与其他蛋白没有序列相似性,能够不停地在细胞核和细胞质之间穿梭,从而参与细胞的生命活动,例如基因转录,细胞生长调控等。DRV P18蛋白是否存在并具有ARV P17蛋白的功能或其他功能,这需要试验探究。本研究采用RT-PCR扩增获得DRV P18基因,将其亚克隆至原核表达载体pCold-TF,表达并纯化获得P18重组蛋白。以此重组蛋白为免疫原,制备抗P18的多克隆抗体。Western-blot结果显示,该抗体具有良好的免疫原性。以此制备的抗体为一抗,利用IFA和激光共聚焦检测DRV感染细胞后,P18蛋白亚细胞定位及动态分布。结果显示,在病毒感染后6 h,P18蛋白在细胞浆和细胞核中均能检测到,之后P18蛋白的分布以细胞核为主,在感染后30 h,P18蛋白在细胞核检测到,而细胞浆里未能检测到;随后细胞崩解。上述结果为深入探讨P18蛋白入核分子机理提供了线索,为临床早期诊断提供了依据。但P18蛋白的功能尚有待深入研究。另外,呼肠孤病毒致病力发生改变、宿主发生变化的原因一直没有突破性进展,缺少DRV反向遗传操作平台是主要的制约因素之一。随后本研究利用全长cDNA扩增法对本实验室保存的一株呼肠孤病毒TH11株进行了全基因序列测定。通过RT-PCR的方法获得全基因组序列后,改造pSK载体,成功克隆出了包含TH11株10个基因节段的质粒,其中在构建M2节段质粒时,用定点突变的方法,在M2节段引入HindIII酶切位点作为分子标签。将10个质粒使用SDS碱裂解法大提,按照不同浓度同时共转染进入BHK-21细胞。在转染72h后,将转染后的细胞接SPF鸡胚,并盲传3代,收集鸡胚的尿囊液进行鉴定,将拯救的病毒命名为rDRV,对拯救的病毒进行RT-PCR、分子标签检测,结果证明本实验成功拯救了带有分子标签的水禽呼肠孤病毒,并且命名为rDRV;随后采用间接免疫荧光(IFA)发现拯救病毒和亲本毒都可以产生绿色荧光,Western-blot结果显示拯救病毒和亲本毒都可以与σC多抗血清、P18多抗血清产生特异性结合;动物回归试验证明拯救病毒和亲本毒都可以致死雏鸭,;对拯救毒株rDRV进行生长曲线、蚀斑试验等检测,结果表明拯救病毒rDRV和亲本毒DRV具有基本一致的生长曲线,产生空斑的数目基本相同,说明拯救病毒rDRV与亲本毒DRV复制特性基本一致。综上所述,本研究初步鉴定了DRV的P18蛋白的功能,为禽呼肠孤病毒临床早期诊断提供了依据,并成功构建出水禽呼肠孤病毒DRV的反向遗传操作系统,利用此系统拯救的病毒生物学特性与亲本毒相一致,利用该平台可以快速、准确地对基因进行删除、替换、突变等操作,为深入开展DRV的传播机理、致病机制、基因功能和免疫防治等研究奠定了基础。