SIV入侵血脑屏障的分子机制探讨

作     者：黄丹 

作者单位：北京协和医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：魏强

授予年度：2016年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：艾滋病脑病 血脑屏障 游离病毒 CD44 hTERT 

摘      要：获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）简称艾滋病,是人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）感染机体后,引起的一种以细胞免疫功能缺陷、反复机会性感染、恶性肿瘤及中枢神经系统退行性病变为特点的综合症。HIV进入人体后,不仅攻击免疫系统,还常常伴随有严重的神经侵袭性,通常的病理变化为星形神经胶质细胞增生为主的神经胶质细胞增生、血管周围淋巴细胞和巨噬细胞侵润。临床上表现为从急性脑炎到HIV痴呆合并症等一系列不同的变化。在动物模型中,CNS疾病通常与脑实质特别是HIV对胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质神经细胞的直接感染相关。那么,HIV是怎样进入CNS的呢?目前研究表明,HIV/SIV在感染早期即可穿透血脑屏障（BBB）,侵入中枢神经系统（CNS）。关于其感染机制,存在几种不同的假说,其中比较公认的是：（1）病毒直接侵入假说;（2）单核-巨噬细胞侵入假说;（3）T细胞诱导假说;（4）液相入胞假说等。简单来说,即病毒以游离病毒的形式或以感染病毒的细胞为载体,藉由上皮细胞或细胞间紧密连接处进入并感染中枢神经系统。那么究竟游离病毒直接感染内皮细胞的感染方式,还是感染的T淋巴细胞介导的感染方式是SIV入侵血脑屏障的主要途径呢?如果细胞介导的感染方式是主要途径,那在,感染的淋巴细胞与内皮细胞作用时,又是什么分子发挥了促进SIV感染内皮细胞的作用呢?第一部分：游离SIVmac239病毒与T细胞介导两种方式感染内皮细胞的效果比较。游离病毒直接感染与细胞介导两种感染方式,无疑是HIV/SIV感染细胞的两种方式。有研究表明,在HIV感染CD4+T细胞时,感染的T细胞与未感染的T细胞间的接触,会形成一种特殊的结构-病毒学突触。这种结构会促进HIV病毒从感染细胞到未感染细胞的高效转移。这种细胞介导的感染方式是游离病毒直接感染方式效率的100倍之多。那么在SIV感染内皮细胞时,感染的T细胞与内皮细胞共培养,会不会也由于细胞间的接触,促进SIV对内皮细胞的感染呢?为此,我们采用游离SIV病毒直接感染内皮细胞和SIV感染的CEMx174细胞与内皮细胞共培养的两种方式,通过巢式PCR、间接免疫荧光法、Western blotting以及ELISA检测内皮细胞的感染程度。我们发现,两种感染方式都能在内皮细胞内检测到前病毒DNA。但感染细胞与内皮细胞共培养时,内皮细胞内前病毒DNA含量、SIV P27蛋白表达量和细胞培养上清中P27含量远高于游离病毒直接感染的方式。所以我们得出结论：细胞介导的感染方式相较于游离病毒直接感染方式对内皮细胞的感染能力更强,可能是SIV病毒入侵血脑屏障的主要途径。第二部分：CD44分子与透明质酸分子的相互作用对SIV感染内皮细胞的影响。淋巴细胞表面的CD44分子与内皮细胞表面的透明质酸分子参与了淋巴细胞与内皮细胞的相互作用,有证据显示在体外淋巴细胞表面的CD44分子能通过透明质酸依赖的途径结合到内皮细胞上。既然T细胞表面的CD44分子与内皮细胞表面的HA分子能相互作用促进淋巴细胞的归巢,那么这种相互作用又能否促进SIV对内皮细胞的感染呢?为此,我们采用IFA、Western blotting、FCM等方法,通过荧光共定位证明了T淋巴细胞表面的CD44分子确实可以和内皮细胞表面的透明质酸分子相结合,促使淋巴细胞对内皮细胞的粘附作用。通过添加外源性的透明质酸分子与淋巴细胞表面的CD44分子竞争性结合,以及利用透明质酸酶减少透明质在内皮细胞表面的分布有效地降低了SIV通过T细胞介导的途径对内皮细胞的感染。同理,利用抗体封闭T淋巴细胞CD44分子与透明质酸分子的结合位点,降低CD44-HA的结合,同样降低了SIV对内皮细胞的感染。第三部分：大鼠间充质干细胞的永生化。由于在研究SIV入侵血脑屏障时,缺乏工具细胞-恒河猴脑毛细血管内皮细胞,导致我们在研究SIV入侵血脑屏障时,使用与脑毛细血管内皮细胞均为CD4-的猴视网膜脉络丛内皮细胞（RF/6A）。本实验选用全骨贴壁法分离大鼠的间充质干细胞,14d即可在显微镜下观察到梭形透亮状态良好的贴壁细胞,经流式鉴定P3代CD90+细胞占总体细胞的95.6%。通过重组腺病毒介导的方法使hTERT基因在大鼠骨髓间充质干细胞的异位稳定表达,诱导端粒酶性,维持细胞染色体核型的稳定,目的是使大鼠骨髓间充质干细胞的寿命明显延长成为具有分化潜能且无限增殖潜能的理想细胞材料。为恒河猴MSC细胞永生化的研究起到了铺垫作用。而恒河猴MSC细胞永生化无疑为分化出脑毛细血管内皮细胞提供了良好的基础。总的来说,我们研究发现SIV进入BBB的主要途径应该是以感染细胞为载体对脑内皮细胞的感染。血液中大量感染细胞（单核巨噬细胞和T细胞）与脑内皮细胞之间发生高效的病毒转移,使病毒进入脑实质。而游离病毒的直接感染也是病毒进入的途径,但由于其感染效率较低,不是主要途径。CD44分子与透明质酸分子在T淋巴细胞与内皮细胞的相互作用中起到了至关重要的作用,当CD44分子与透明质酸分子的结合被减弱时,将有效地降低了SIV通过T细胞介导的途径对内皮细胞的感染。