纳米三氧化二锰智能控释诊疗体系构建及初步应用

作     者：祝杏 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张振中

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：ART 肿瘤靶向 溶酶体逃逸 肿瘤深部渗透 诊疗一体化 

摘      要：随着科技发展及医疗水平的提升,肿瘤靶向治疗被越来越多的人所关注。纳米载体的发展为抗肿瘤药物递送系统的研究打开了新的大门,解决了抗肿瘤药物在水溶性和稳定性方面的不足,同时提高了药物对肿瘤靶标的选择性。而且通过智能纳米载体的设计,还可实现递药系统在肿瘤微环境中的特异性响应释药,降低毒副作用的同时有效增强了化疗药物的抗肿瘤效果。青蒿素(ART)作为一类Fe依赖性抗肿瘤药物,通过与Fe反应致使过氧桥断裂,产生活性氧(ROS),进而杀伤肿瘤细胞。但是该类药物的水溶性差、治疗所需剂量大等问题极大的限制了其后期的临床应用。本课题选用中空介孔纳米三氧化二锰(MnO)对其进行负载,以改善ART水溶性差、所需剂量大等问题。因MnO的中空介孔结构可能导致药物在体内递送过程中的泄漏,且作为外来物质,MnO易被体内巨噬细胞识别、吞噬并清除。故本课题采用同源性红细胞膜(RBCm)对MnO-ART进行包封,一方面将MnO表面的介孔封堵,避免药物在体内运输中的泄漏;另一方面红细胞膜作为内源性物质,可以减少甚至避免体内免疫系统吞噬,实现体内长循环,使药物更多的被递送到肿瘤病变部位。另外,为增加纳米递药系统在肿瘤部位的蓄积量,实现肿瘤细胞的有效摄取,我们采用TKD多肽对RBCm-MnO-ART纳米粒进行表面修饰,该多肽以乳腺癌MCF-7细胞表面过量表达的热休克蛋白为识别位点,因而,修饰后的递药系统可通过配体-受体途径实现肿瘤的主动靶向。体外表征结果显示TKD@RBCm-MnO-ART粒径为403.4±15nm,电位是-23.7±2.7eV,证明其具有良好的稳定性。透射电镜结果表明,载体在体外模拟肿瘤微环境中反应1h时,呈现粒径约为50nm的均匀小纳米粒,反应4h后粒径减小至6nm左右。磁共振成像实验结果表明,MnO在肿瘤微环境中生成Mn,弛豫率为6.3113mMS,具有良好的成像能力。体外释药结果显示,MnO-ART在pH=7.4的PBS的环境中48h累积释药率达到50.72%,在pH=7.4 C=5mM的环境中48h累积释药率达到97.5%;48h包膜后的RBCm-MnO-ART的累积释药率为91.44%。表明肿瘤微环境促进药物的释放,包膜后对药物释放无明显影响。体外选用人乳腺癌MCF-7细胞为模型。抑制率结果显示MnO载体无明显细胞毒性,负载ART后,可显著增强ART的抗肿瘤效果。细胞摄取实验结果表明,红细胞膜的包裹可减少巨噬细胞对MnO的吞噬,靶分子多肽TKD的进一步修饰显著增强了RBCm-MnO-FITC对癌细胞的特异性识别能力,可降低正常乳腺bst细胞的摄取,更高效的靶向肿瘤。细胞共聚焦实验结果表明TKD@RBCm-MnO进入肿瘤细胞后首先进入溶酶体,导致溶酶体胀破,随着时间的延长,载体向细胞核移动,并嵌入细胞核。ROS实验、Calcein-AM/PI细胞活性实验、细胞周期实验及彗星实验结果显示,TKD@RBCm-MnO-ART对细胞的周期阻滞作用不明显,主要通过产生大量的ROS诱导肿瘤细胞凋亡、损伤DNA达到杀伤肿瘤细胞的目的。体内实验选用荷MCF-7细胞的裸鼠为动物模型。活体成像结果表明红细胞膜的包封可延长体内循环时间,降低代谢速率;TKD的修饰显著增加了TKD@RBCm-MnO-IR783在肿瘤部位的蓄积。肿瘤组织渗透实验结果显示,通过载体在肿瘤组织的结构变化,可增加药物从肿瘤微血管渗透至肿瘤深部的距离,实现药物在肿瘤的均匀分布。组织切片HE染色结果表明制剂对体内正常组织无明显毒性。从肿瘤体积变化及肿瘤组织HE染色结果可知,与ART组相比,制剂组肿瘤细胞皱缩坏死显著,肿瘤体积增长缓慢,表明该纳米制剂可显著提高ART的体内抗肿瘤效果。磁共振成像实验结果表明TKD@RBCm-MnO-ART可在肿瘤微环境中,结构破坏生成Mn,作为造影剂实现肿瘤的诊疗一体化,具有远大的发展前景。