农杆菌核酸酶Atu4108及鼠伤寒沙门氏菌调控蛋白STM1987和ArtⅠ的结构和功能研究

作     者：高斐 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谷立川

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：DEDD结构域 核酸外切酶 降解 c-di-GMP L-精氨酸 

摘      要：核酸外切酶是一类多样性群体,对于有机体的新陈代谢起着非常重要的作用,它可以切断核酸的磷酸二酯键。它的催化机理与生物功能之间的联系非常微弱。在大多数情况下,一个细菌细胞中就含有几十个核酸酶,但由于他们的底物多样性以及不同酶的底物之间的重叠性,使科学家们很难确定酶的底物和它物理作用之间的关系。DEDD超家族是核酸外切酶中的一大类,它们广泛存在于真核和原核生物中,所有的DEDD家族核酸酶都有非常保守的DEDD基序,它们可以分成两个亚群,DEDDh和DEDDy。分类的依据是DEDD基序中最后一个D之后的4-5个残基是组氨酸还是酪氨酸。DEDD核酸酶家族的成员都有利用两个金属离子的催化作用来水解DNA或RNA的机制。DEDD核酸酶通常以二价的镁离子或锰离子为辅因子。RNaseD是DEDDy类型的核糖核酸外切酶,它存在于许多细菌基因组中,它的碳端有两个HRDC结构域。HRDC结构域的作用可能是参与底物的结合以及保证RNaesD的持续合成能力。HRDC结构域在许多细菌基因组中并不保守,很多RNaseD的同源蛋白都缺失一个或两个HRDC结构域,例如农杆菌中,就包括很多短的RNaseD同源蛋白。在大肠杆菌中,只有寡核糖核酸酶Orn可以降解小RNA,巴尔通氏体中的NrnC就被认为是Orn的功能类似物。NrnC是一个短的RNaseD同源蛋白,Orn同样不含有HRDC结构域,属于DEDDh类型的核酸外切酶。为了更好的理解为什么缩短的RNaseD类似蛋白可以代替Orrn的突变株在大肠杆菌的功能,选择了Atu4108作为研究对象,它是NrnC同源蛋白,它没有碳端的HRDC结构域。最终我得到了 Atu4108native的结构以及结合两个锰离子的结构,并进行了一系列酶活实验验证,证明Atu4108既能降解DNA 又能降解RNA。这是第一个短的RNaseD类似蛋白的结构且它是一个八聚体。实验得出的Atu4108对降解DNA和RNA的极高的酶活性也是第一次被发现。Microbiology杂志2015年六月九号刊登的一篇名为A direct screen for c-di-GMP modulators reveals a Salmonella Typhimurium periplasmic L-arginine-sensing pathway的文章中鉴定出了两个蛋白,一个是ArtI,这是一个假定的L-精氨酸周质结合蛋白,另一个是STM1987,这是一个二鸟苷酸环化酶。文章预测了两个鼠伤寒沙门氏菌中L-精氨酸参与调节c-di-GMP浓度的模型。A.周质间感知通路模型:ArtI与STM1987的Cache1结构域直接或间接相互作用,L-精氨酸结合到ArtI上,提高了 STM1987的GGDEF结构域调节c-di-GMP合成酶的活性,以提高c-di-GMP的合成能力。B.细胞质的感知通路模型:在胞质溶胶中,L-精氨酸通过一种未知机制来激活STM1987。通过蛋白表达与纯化,我纯化出了 ArtI和STM1987蛋白的Cache1结构域的蛋白。我希望通过对两个蛋白的三维结构进行分析,得到一个L-精氨酸调节c-di-GMP浓度的通路的模型。最终我只得到了 ArtI的结构,ArtI的蛋白结构中带有一个精氨酸。我希望能得到Cache1结构域的蛋白的结构。