利用基因芯片技术筛选奶牛外周血热应激相关基因

作     者：陆诚 

作者单位：浙江师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒋永清

授予年度：2010年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：基因芯片 热应激 免疫 凋亡 热休克蛋白 

摘      要：热应激反应机制的分析与阐释,对于控制热应激反应,使动物表现出最佳的生理性能,在高温环境下保持正常的生理状态和健康体能,都具有重要的理论意义和实际应用价值。因此,对于热应激反应机制的分析,尤其是其分子遗传机制的研究,一直都是生命科学研究的一个重要方向。本试验以金华伊康乳业奶牛场30头中国荷斯坦牛和25头含25%以色列荷斯坦牛血统的杂交中国荷斯坦牛作为研究对象,分别从尾静脉采8mL血液作为试验材料。动物间耐热能力不同,是由其耐热性状相关的基因表达差异所决定的。将新鲜的血液分别在42℃热暴露不同时间,也会引起热应激相关基因的表达差异。因此采用Affymetix公司的基因表达谱芯片筛选并研究了各组间相同处理及各组内不同处理之间的差异表达基因,即热应激相关基因。芯片结果发现奶牛的CCL3基因在中国荷斯坦牛热激1小时和4小时后表达上调,且Genbank上没有其全序列。因此克隆了奶牛CCL3的全长片段,并进行初步的生物信息学分析。 结果如下： ①将芯片数据进行聚类分析,得到差异表达基因257个,其中基因表达上调139个,基因表达下调118个。这些差异表达基因主要涉及细胞凋亡(22/4,即上调基因22个,下调基因4个,下同)、免疫应答(37/14)、氧化还原(3/8)、细胞增殖与分裂(5/7)、代谢相关(14/19)、信号转导(14/8)及调控转录(16/5)、其它(26/62)等生物功能和过程。这些过程都与奶牛的热应激反应息息相关,反映了热应激过程的分子变化基础。其中热休克蛋白家族和趋化因子家族与奶牛的热应激关联尤为紧密。 ②成功克隆了奶牛CCL3的全长cDNA序列,共829bp,其5’UTR较之NM74511延伸了15bp,3’UTR延伸了453bp。其中5’UTR长度为83bp(1-83bp);开放阅读框282bp(84-365bp),编码93个氨基酸;3’UTR 464bp(366-829bp)。其中终止密码子后的407bp处出现动物mRNA中常见的加尾信号AAUAA,其后延伸22bp即出现polyA尾。发现在开放阅读框的+8位T→C,+9位C→G,+10位G→C,+195位T→C突变。且使蛋白的第3位缬氨酸→丙氨酸,第4位丙氨酸→脯氨酸。 ③分析结果显示奶牛CCL3蛋白是分子量为10117.7D,pI为6.11,亲水性评估为0.246,脂溶指数为83.98的疏水性蛋白。哺乳动物顺CCL3蛋白的同源比对结果显示奶牛CCL3蛋白与亚洲水牛同源性最高为95%,与其他哺乳动物依次为猪88%;猫81%;马79%;兔和大鼠75%;犬74%;仓鼠73%;小鼠72%;棉鼠、人和黑猩猩70%,猕猴则仅有66%。 ④在蛋白的信号肽预测、糖基化、磷酸化位点预测中发现奶牛CCL3蛋白存在信号肽序列,且最可能的切割位点在23S和24A氨基酸残基间。3A(Ala)丙氨酸和47I(I1e)异亮氨酸残基可能存在糖基化位点。44S的丝氨酸(Ser)、30T和67T的苏氨酸(Thr)和38Y的酪氨酸(Tyr)存在磷酸化位点。功能域分析中发现奶牛CCL3蛋白存在chemokine-CC和chemokine-CXC功能域,且属于CC趋化因子亚家族。 总之,本研究获得的差异表达基因为今后进一步研究奶牛的耐热性能分子基础,和耐热品种选育提供了一个有利的参考基因群。