TRIM31在肝细胞肝癌转移与肿瘤进展中的作用与分子机制

作     者：郭蓬勃 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韩丽辉

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：TRIM31 肝细胞肝癌 肿瘤转移 失巢凋亡 p53 肿瘤治疗 mTORC1 TSC1-TSC2复合体 

摘      要：研究目的TRIM31 （tripartite motif-containing protein 31）是TRIM家族的一个成员。TRIM31由三个结构域组成,分别是Ring结构域,B-box结构域和coiled-coil结构域。由于Ring结构域的存在,TRIM家族成员大都具有E3泛素酶的活性。之前研究发现,TRIM家族成员能够参与一系列机体的生理及病理过程,包括细胞生长、凋亡、转录调节及肿瘤形成等。然而,TRIM家族成员在肝细胞肝癌中的研究较少,TRIM 31与肿瘤的关系,仅在胃癌和非小细胞肺癌中有研究,在肝癌及其它恶性肿瘤中并无相关研究报道。本课题旨在阐明TRIM31在肝细胞肝癌转移和肿瘤进展中的作用及相关分子机制。第一部分TRIM31在肝细胞肝癌恶性转移中的作用及机制肿瘤转移是一个多步骤的过程。正常上皮细胞脱离细胞外基质附着后会诱发凋亡,即“失巢凋亡;而恶性肿瘤细胞获得了抵抗失巢凋亡的能力,进入脉管系统后能够以锚定非依赖性的方式存活,是肿瘤转移的重要前提。本部分研究旨在阐明TRIM31在肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中的表达状况、作用效应及其分子机制,为阐明肝癌细胞抵抗失巢凋亡并进一步侵袭转移的分子机制和对其进行靶向逆转奠定基础。材料方法1.建立脱离附着的细胞模型1.1为模拟肝癌细胞在体内原位生长以及脱离细胞外基质附着继续存活的状态,我们在体外将肝癌细胞接种于2-羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）覆盖的培养板中,由此建立了肝癌细胞的失巢模型。1.2 Real-time PCR及Western blot方法检测TRIM31在贴壁生长及失巢后的肝癌细胞中的表达差异。2. TRIM31对肝癌细胞抵抗失巢凋亡的影响培养细胞至指数生长期,用靶向TRIM31的SiRNA （Si-TRIM31）转染肝癌细胞,并以无关序列做对照。构建肝癌细胞失巢模型,用CCK-8法检测干扰TRIM31后对肝癌细胞抵抗失巢凋亡效应的影响。分别应用Transwell实验和克隆形成实验检测干扰TRIM31后对失巢后的肝癌细胞的侵袭转移力和克隆形成能力的影响。3. TRIM31发挥作用的信号通路及分子靶点检测3.1培养细胞至指数生长期,用靶向TRIM31的SiRNA （Si-TRIM31）专染肝癌细胞,并以无关序列做对照。建立失巢的细胞模型,继续培养24h后进行蛋白提取。用Western Blot方法检测细胞凋亡情况及凋亡通路变化。3.2应用免疫共沉淀和Western blot等方法检测TRIM31发挥作用的分子靶点及其机制。实验结果1. TRIM31在失巢后的肝癌细胞中表达上调且介导肝癌细胞对失巢凋亡抵抗效应1.1 TRIM31在失巢后的肝癌细胞中表达上调用Real-time PCR及Western blot方法检测结果显示,与贴壁生长的肝癌细胞相比,TRIM31的mRNA水平及蛋白水平在失巢后的肝癌细胞中表达显著上调。1.2 TRIM31介导肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应将肝癌细胞接种于普通六孔板中,转染TRIM31小干扰RNA（Si-TRIM31）,并以转染无关序列（Si-NC）组作为对照。经过Real-time PCR及Western blot验证,靶向TRIM31的Si-TRIM31能够显著性抑制TRIM31的表达水平。1.2.1 TRIM31介导了肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗我们应用CCK-8实验对失巢后肝癌细胞的存活能力进行了检测。结果显示,与对照组相比,Si-TRIM31转染组失巢后肝癌细胞的死亡率大大提高。该结果提不,TRIM31的表达被抑制后,肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗被显著逆转。进一步通过Western blot和Caspase-3剪切底物试剂盒对失巢后肝癌细胞的凋亡水平进行了检测,结果显示干扰TRIM31表达后,失巢后的肝癌细胞发生明显的凋亡反应。该结果提示,TRIM31介导了肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应。1.2.2 TRIM31参与介导了失巢后的肝癌细胞的侵袭转移Transwell实验结果显示,与贴壁生长的肝癌细胞相比,失巢后的肝癌细胞侵袭转移力显著增强,而用小干扰RNA沉默TRIM31表达之后,穿过transwell上室膜的肝癌细胞明显减少,提示TRIM31参与介导了失巢后肝癌细胞的侵袭转移能力的增强。1.2.3 TRIM31参与介导了失巢后的肝癌细胞的克隆形成克隆形成实验结果显示,失巢后的肝癌细胞克隆形成能力显著增强,而用小干扰RNA沉默TRIM31的表达之后,失巢后的肝癌细胞的克隆形成能力明显减弱,提示TRIM31介导了失巢后肝癌细胞的克隆形成能力的增强2. TRIM31通过活化AMPK信号通路介导肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应2.1 AMPK通路的活化在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中发挥重要作用培养细胞至指数生长期,构建失巢的肝癌细胞模型,利