肝线粒体酒精性损伤中frataxin的介导效应与槲皮素保护机制

作     者：汪静 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姚平

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：酒精 槲皮素 线粒体 frataxin 铁代谢 ROS 

摘      要：目的:线粒体损伤是酒精性肝病(ALD)早期且贯穿始终的重要病理改变。本研究旨在探讨肝线粒体酒精性损伤中frataxin的作用与病理生理学意义,以及槲皮素的保护效应与潜在机制。方法:1.动物实验60只雄性C57BL/6J小鼠随机分为四组:正常对照组(喂饲正常Lieber De Carli液体饲料)、槲皮素对照组(100 mg/***.)、酒精组(喂饲含乙醇供能30%的Lieber De Carli液体饲料)、槲皮素+酒精组。等能量配对喂养15周建立肝线粒体酒精性损伤模型后,采集肝脏样本检测下列指标:(1)线粒体超微结构和线粒体膜电位;(2)线粒体总铁和可变铁池(LIP)水平;(3)胞浆和线粒体活性氧(ROS);(4)frataxin蛋白的含量。2.细胞实验shRNA/shRNA慢病毒转染HepG2细胞,分为对照组、酒精组(100 mM)、槲皮素组(50μM)和酒精+槲皮素组。检测以下指标:(1)线粒体膜电位和胞浆ROS;(2)细胞LIP和铁蛋白轻链(FTL)蛋白水平;(3)frataxin、线粒体铁转运蛋白(MFRN2)、亚铁螯合酶(FECH)蛋白水平。结果:1.与对照组相比,长期酒精摄入导致小鼠肝脏线粒体超微结构损伤,线粒体膜电位降低,同时线粒体总铁和LIP水平明显增加,胞浆和线粒体ROS均增加,frataxin蛋白表达降低。槲皮素干预明显改善酒精对线粒体结构和膜电位的损伤,缓解线粒体铁水平的异常,同时减轻酒精导致的小鼠肝脏胞浆、线粒体ROS上升和frataxin蛋白表达抑制。***和shRNA细胞经酒精处理,frataxin蛋白水平分别降低41%和17%。Frataxin沉默与shRNA对照组相比frataxin蛋白水平减少65%,shRNA酒精处理与shRNA酒精处理相比,frataxin蛋白表达进一步减少50%。槲皮素干预有效增加frataxin沉默细胞frataxin蛋白表达,减轻酒精对frataxin蛋白水平的抑制。3.在shRNA细胞中,与对照组相比,酒精处理导致胞浆ROS增加,线粒体膜电位降低,FTL蛋白水平上升而LIP水平下降,MFRN2和FECH蛋白表达增加;在shRNA细胞中,与对照组相比,酒精处理导致胞浆ROS增加,线粒体膜电位降低,FTL蛋白水平上升而LIP水平下降,MFRN2蛋白表达无明显改变而FECH蛋白表达增加。与shRNA对照组相比,frataxin沉默后胞浆ROS增加,线粒体膜电位降低,FTL蛋白水平和LIP水平均降低,MFRN2和FECH蛋白表达增加。shRNA酒精组与shRNA酒精组相比,胞浆ROS进一步增加,线粒体膜电位进一步降低,FTL蛋白增加幅度有所下调而LIP进一步减少,MFRN2蛋白增加幅度不变而FECH蛋白进一步增加。槲皮素干预明显改善frataxin沉默和酒精导致的胞浆ROS上升和线粒体膜电位降低,同时降低FTL蛋白和LIP水平,但对MFRN2和FECH蛋白表达无明显影响。结论:酒精摄入导致肝脏线粒体frataxin的蛋白水平下降,线粒体出现铁沉积和氧化应激,以及结构和功能的异常。槲皮素对酒精性肝线粒体损伤发挥良好的拮抗效应,可能机制与恢复frataxin蛋白表达水平防止线粒体铁过载有关。