过氧亚硝酸根对p53中酪氨酸硝化作用及对其活性影响的研究

作     者：丁杨 

作者单位：北京工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗云敬

授予年度：2013年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 071009[理学-细胞生物学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：p53蛋白 过氧亚硝酸根 高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱 分子动力学模拟 

摘      要：p53蛋白在人体内是由TP53基因编码的一种肿瘤抑制蛋白，它在细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡和遗传稳定性等生理过程中起重要的作用。p53蛋白能够诱导细胞停止分裂，并激活DNA修复蛋白，同时，它能够启动细胞的程序性死亡，故又称为“基因组的守护者。p53蛋白功能的缺失或结构的损坏会使其丧失对细胞周期的调控作用，导致细胞的无限分裂，最终形成肿瘤。 过氧亚硝酸根离子(ONOO)是生物体内由一氧化氮自由基(NO)和超氧阴离子(O)快速结合生成的一种细胞毒性物质。生理条件下ONOO能够质子化为过氧亚硝酸(ONOOH)从而穿越细胞膜，其强大的氧化和硝化能力可导致生物大分子包括蛋白质、脂质和DNA的损伤。其中蛋白质酪氨酸的硝化是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，可以使蛋白质变性并产生一系列的细胞毒性作用从而诱发疾病。可见，生物体内的蛋白质酪氨酸硝化有着重要的生理、病理学影响。 本研究以p53蛋白为目标分子，以ONOO为诱导剂，结合生物体内微环境，应用电泳仪、紫外-可见分光光度计、高效液相色谱和质谱等现代分析仪器，运用Western Blot、分子动力学模拟等手段研究了ONOO对p53蛋白结构的改变以及其在翻译后修饰水平的上造成的损害。 首先通过重组质粒及大肠杆菌原核表达系统制备了GST-p53融合蛋白，并且经过谷胱甘肽凝胶层析柱对融合蛋白进行了提纯分离。人重组P53蛋白的表达制备有着重要的应用价值。纯化的GST-p53融合蛋白为之后的研究和实验奠定了基础。 其次采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱(HPLC-ESI-ITMS)方法研究了ONOO介导的p53蛋白酪氨酸硝化的反应过程和选择性。通过对硝化浓度和反应体系的生理模拟，液质联用体系的条件优化，使蛋白质残基识别覆盖率达到了85%，识别出9个酪氨酸中的6个，并鉴定出其优先硝化位点为Tyr107，Tyr163，Tyr327。然后通过Western Blot验证了ONOO对p53蛋白的活性损伤并得出ONOO的浓度在10mM级时即可使p53蛋白失去活性。 最后，在实验研究的基础上，对p53蛋白的硝化产物进行了分子动力学模拟，来阐明3-硝基酪氨酸的产生对p53蛋白的二级结构的影响，并对p53蛋白中酪氨酸的硝化选择性进行了推理解释。Tyr107受附近负电性和疏水性氨基酸残基的影响而易被硝化，Tyr163与Arg249形成的п-共轭和空间疏水位，Tyr327残基的暴露都使它们成为容易被硝化的位点。硝化后的Tyr107、Tyr163、Tyr327对p53蛋白的二级结构也造成了较大的影响。 本实验制备并提纯了p53蛋白，鉴定了ONOO诱导的p53蛋白酪氨酸的硝化修饰热点及其对蛋白活性的影响，并结合分子动力学模拟给出了合理的解释，期望能初步阐明ONOO损伤p53蛋白并引发癌症产生的机理，为预防癌症和药物开发提供一定的理论支持。