大鼠胰岛分离纯化技术的改进与同种异体移植的实验研究

作     者：吴建红 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：方马荣

授予年度：2006年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：大鼠 胰岛细胞 分离 纯化 同种异体移植 

摘      要：研究背景 糖尿病是一种自身免疫缺陷和环境因素共同作用所致的内分泌代谢紊乱性疾病，原因是胰岛β细胞损坏造成胰岛素相对或绝对分泌不足，严重威胁着人们的健康和生命;糖尿病治疗已成为21世纪医学面临的最大挑战。虽然随着现代生物医学技术的发展，外源性胰岛素能非常有效的控制血糖，但由糖尿病引起的慢性并发症和外源性胰岛素注射所带来的低血糖现象仍然明显影响着患者生活质量。胰岛移植是治愈糖尿病最有效的方法，但移植时所需的大量胰岛是制约胰岛移植广泛应用于临床的最大障碍。 研究目的 探索如何获得足够数量、高纯度和具有活性的胰岛细胞方法;把用不同方法分离纯化得到的胰岛细胞移植于同种糖尿病大鼠肾被膜下，比较胰岛移植物起效时间，为胰岛移植应用于临床提供必要的实验基础。 材料和方法 在相同实验条件下，用不同方法分离纯化SD大鼠胰岛，A、B组各6只采用胆总管逆行Hank’s液(含1mg／ml胶原酶V和2.5％甘油)原位灌注法取胰腺，C组6只直接取胰腺后用胶原酶V消化。A、C组胰岛用Ficoll间断密度梯度离心法纯化，B组胰岛用孔径为100μm滤网过滤纯化。计数直径50um以上胰岛细胞团;双硫腙(DTZ)染色判别胰岛纯度;台盼蓝染色胰岛估计存活率;移植物切片后，在显微镜下观察胰岛生长情况以判定胰岛功能。把A、B组获取的胰岛分别移植于D、E组链尿菌素(STZ)诱导的同种糖尿病大鼠肾被膜下，每组6只，在不使用任何免疫抑制剂的情况下评价移植物起效时间和被排斥时间。 结果 胰岛分离后纯化前收获量(个)、胰岛纯度(％)和存活率(％)，A组分别为562±59、43.7±4.0、97.5±1.5;B组分别为600±62、43.9±3.2、97.0±1.2;C组分别为346±41、43.1±2.6、96.3±1.3。纯化后胰岛收获量(个)、胰岛纯度(％)和存活率(％)，A组分别为352±33、83.7±2.1、91.0±1.3;B组分别为494±56、53.0±3.7、94.7±1.9;C组分别为236±24、80.6±2.4、82.9±2.2。结果表明：A组和B组用同样分离方法获取的胰岛在数量、纯度、活性三方面比较差异无显著性，相比C组用不同方法分离胰岛在收获数量上明显较多，差异有显著性(P均0.01)，纯度和活性无差异;A组和B组用不同方法纯化后再比较，在胰岛收获的数量、活性方面B组明显高于A组，差异有显著性(P均0.01)，纯度A组高于B组，差异有显著性(P0.01);C组经与A组用相同方法纯化后，与A组比，收获的胰岛数量少、活性低，差异有显著性(P均0.01)，纯度A组高于C组(P0.05)，C组高于B组(P0.01)。 胰岛移植结果，A、B组胰岛细胞分别移植于D、E组糖尿病大鼠。移植后D组分别在48-72小时后血糖开始下降至正常，平均为64±9.8小时;E组分别在36-48小时后血糖开始下降至正常，平均为42±6.6小时，在移植物起效时间上E组明显早于D组，差异有显著性(P0.01);平均排斥时间：D组为第10.7±2.0天后，E组为第6.8±1.9天后，D组存活时间长于E组，差异有显著性(P0.01)。移植物经石蜡包埋切片处理，在显微镜下可见移植物内有形态结构完整的胰岛细胞团，细胞团内有毛细血管生长，与正常大鼠胰腺的胰岛细胞团相似。 结论 1．胰岛分离的理想方法是：采用22号或24号套管针逆行插入胆总管，原位灌注Hank’s液(含1mg／ml胶原酶V和2.5％甘油)，待胰腺充分膨胀后分离胰腺。 2．用滤网过滤纯化胰岛相比用Ficoll间断密度梯度离心法纯化胰岛，收获量和活性均要高， 移植物存活早、降血糖早，可作为今后胰岛移植的参考方法。