三聚氰胺与三聚氰酸及其混合暴露下对酿酒酵母影响的研究

作     者：权文琦 

作者单位：华中师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：原弘

授予年度：2018年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：MARCs 细胞膜通透性 流式细胞术 磷脂脂肪酸 eGFP蛋白 

摘      要：三聚氰胺及其相关物(MARCs)自2008年“毒奶粉事件以来便一直是食品安全关注的热点。关于MARCs的化学性质、代谢、生物学效应、毒理学等相关研究表明,尽管三聚氰胺(MEL)和三聚氰酸(CA)的急性毒性较低,但在哺乳动物体内,这些化合物很难进行体内代谢,通常是经尿液排出,但当大剂量使用时,这些化合物就会有显著的肾脏毒性,以及对心脏等其他器官的毒性作用。因此,对MEL和CA的生物学效应和毒理学效应进行深入研究尤为必要,比如其在体内与生物分子的作用机制如何,若MEL及其相关物共存时是否会产生协同作用等,这就需要从生理、生化、病理等方面作出解答。环境中的MARCs暴露首先作用的生物对象就是微生物,本研究旨在理解MARCs单独及混合暴露对环境微生物——酿酒酵母的表观生物影响及作用机制,通过流式细胞术和气相色谱研究了 MARCs胁迫下酿酒酵母的生长情况、生理变化以及细胞膜磷脂脂肪酸组成和含量的变化;并通过实时荧光定量PCR仪检测了MARCs胁迫下酿酒酵母eGFP基因表达丰度的变化。结果表明,在MARCs胁迫下,酿酒酵母细胞膜的通透性变大,在培养24 h后,染色细胞所占比例都有所增加,并且随着MARCs浓度的变化呈正相关,对于0.25 mg/mL混合暴露的体系,当MEL和CA同时存在且体积比达到1:1时,对酿酒酵母细胞膜通透性的改变达到最大,明显高于0.25 mg/mL单组分暴露的体系;通过气相色谱检测出酿酒酵母细胞膜的7种主要脂肪酸,其中,以不饱和脂肪酸C16:1为主要成分,随着MEL和CA浓度的增大不饱和脂肪酸的含量显著上升,饱和脂肪酸的含量显著下降。不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸相对含量的比值相比对照组由1.4倍上升到3.4倍之多,并且随着MEL和CA的浓度的升高比值逐渐增大;通过流式细胞术检出酿酒酵母eGFP蛋白的表达量随着MARCs浓度的变化呈负相关,MARCs浓度越高,对eGFP蛋白表达的抑制率越高,2.0 mg/mL的MEL和CA单独存在时对eGFP蛋白表达的抑制率分别为17.07%和12.92%,0.25 mg/mL的MEL和CA单独存在时,对eGFP蛋白表达的抑制率分别为9.70%和8.35%,而当0.25 mg/mL的MEL和CA混合暴露条件下,当体积比达到1:1时,对eGFP蛋白表达的抑制率达到20.45%;通过实时荧光定量PCR技术对MARCs胁迫下eGFP基因的相对表达量分析发现,与其eGFP蛋白的表达量变化一致。上述研究表明,在MARCs胁迫下酿酒酵母细胞膜首先受到冲击,引起细胞膜通透性和流动性的变化,并且对酿酒酵母造成一定程度的氧化损伤最终导致细胞凋亡,MEL进入细胞内干扰酿酒酵母的正常代谢过程对其蛋白表达、相关基因表达也有一定程度的抑制作用。从细胞毒性和基因毒性方面对评估MARCs的毒性作用有一定的参考意义。