J亚群禽白血病病毒gp37基因siRNA表达载体的构建及体外干扰效应的初步研究

作     者：孟祥凯 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：成子强

授予年度：2008年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：禽白血病病毒J亚群 gp37基因 siRNA表达载体 RNA干扰 

摘      要：本研究以禽白血病病毒J亚群(ALV-J)gp37基因为靶向基因,以RNA干扰的方法,干扰其表达,以达到限制ALV-J在细胞内复制的目的。 参照Takara和Ambion公司的成功的经验并利用Ambion公司的在线设计工具httpp:***/techlib/misc/siRNA design html,针对ALV-J NX0101株gp37基因序列(编码跨膜蛋白TM)寻找siRNA靶序列,根据siRNA阴性对照设计原则设计相应的阴性对照。经BLAST验证,所选择的靶序列与鸡体和其它病毒基因片段无同源性。在设计的靶序列5’端开始的19个核苷酸为正义链,中间加入9个核苷酸TTCAA GAGA间隔以形成发夹结构,3’端加有转录终止信号TTTTTT。并且5’端带有BamH I(GATCC)酶切位点,3’端带有Xho I ( CTCGAG)和Hind III(TTCGA)酶切位点。靶序列分别被克隆到psilencer2.1-U6载体上。经Xho I酶切鉴定和测序鉴定后,证明已成功地构建了针对gp37基因不同区域的siRNA(small interfering RNA)表达载体。分别命名为pu6gp 37-1,pu6gp37-2,pu6gp37-3, pu6 gp37-4,pu6gp37-5,pu6gp37-6, pu6gp(阴性对照)。 以提取的ALV-J NX0101株病毒基因组DNA为模板,根据Gene Bank上发表的ALV-J NX0101株gp37基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增出gp37 (591bp)基因,克隆到pMD18-T Vector。目的片段经双酶切连接到pEGFP-N1载体上,经酶切和测序鉴定后,证明已成功地构建了gp37基因的融合表达载体,命名为pEGFP-gp37。 用pEGFP- gp37融合表达载体转染CEF细胞,分别在转染后24h, 48h,72h观察荧光的变化。发现转染后24h就可见到荧光,48h荧光最强,72h荧光逐渐减弱,减少;pEGFP- gp37与构建的针对gp37基因不同区域的siRNA表达载体分别两两共转染CEF细胞后,分别在24h, 48h,72h观察荧光的变化,结果发现,共转染48h后与pu6gp37-2、pu6gp37-4质粒共转染的孔荧光均减弱,荧光细胞数减少,初步验证pu6gp37-2、pu6gp37-4对TM蛋白有抑制作用。 本研究为RNAi技术应用于抗ALV-J感染研究奠定了基础并为抗病毒研究提供了新途径。