线性探针技术在耐药结核病诊断中的应用
作者单位：郑州大学
学位级别：硕士
导师姓名：秦东春
授予年度：2018年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
摘 要：背景和目的2017年世卫组织全球结核病报告显示:全球有1040万结核病患者,2016年有180万人死于结核病,结核病成为全球头号传染病杀手。结核病的治疗管理不善,抗菌药物的不正确使用,使用无效药品配方,以及过早中断治疗,都可以引起结核分枝杆菌产生耐药性,并可进而造成传播。在全球范围内我国是耐药结核结核病疫情比较严重的国家,WHO已将我国列为耐多药结核病高负担国家之一。耐多药防治工作存在发现率低,治愈率低等问题。如何有效控制结核病尤其是耐药肺结核疫情,是当前全球结核病预防、控制工作所面临的紧迫问题,同时也是我国传染性疾病防治事业面临的重要挑战。因此,探寻、评估新的耐药结核病早期诊断技术,及时发现、治疗耐药病人,对我国“十三五期间的结核病防治工作有重要的意义。当前我国用于筛查耐药结核病方面应用最广泛的一项基本技术是抗结核药物敏感性试验(DST),该方法最大的缺陷在于检测周期过长,临床时效性较差,不利于临床及时合理选择抗结核方案。近年来结核病分子生物学诊断领域发展较快,涌现出基因芯片、GeneXpert、熔解曲线法、HAIN线性探针检测(Line probe assay,LPA)等技术,不仅可用于结核病诊断,还可对部分抗结核药物进行耐药性检测。其中HAIN线性探针检测是由德国HAIN Lifescience公司开发的一种诊断技术,能通过对rpoB、katG、inhA基因突变进行检测从而判断结核分枝杆菌是否对利福平(RIF)和异烟肼(INH)耐药。本次试验旨在通过HAIN线性探针技术与传统分枝杆菌药物敏感性试验(DST)进行比较分析,评估该技术在耐多药结核病早期诊断中的应用价值;同时对确诊为耐多药结核病(MDR-TB)的患者耐药基因进行分析,探寻导致本地区MDR-TB发生的主要基因位点。方法随机选取2015年5月至2016年2月期间于河南省传染病医院(郑州市第六人民医院)门诊或住院治疗的387例涂片抗酸染色阳性结核病患者,其中男性271例,女性116例,平均年龄(39.3±17.5)岁。对入组患者抗酸阳性生物样本分别进行HAIN线性探针技术检测及分枝杆菌固体培养,对培养阳性菌株进行传统比例法分枝杆菌药物敏感性试验(DST)。从实验室信息管理系统(LIS)上查询两种方法从样本接受至结果审核报告所用的时间,即样本周转时间(TAT),做好试验记录。对HAIN线性探针检测结果与药物敏感性试验结果进行比较,评价HAIN线性探针技术在耐药结核病诊断领域的应用价值。统计学处理采用SPSS 19.0统计软件和Excel软件对各组研究对象的病例信息、检测结果进行数据整理分析。定量资料以均数±标准差(?x±s)表示;定性资料各组研究对象间率的差异采用卡方检验,P0.05即认为差异具有统计学意义;计算Kappa值判断两种检测方法的一致性。结果1.在培养过程中有2例样本出现污染情况,1例样本培养分枝杆菌阴性,无法进一步进行体外药物敏感性试验。有另外3例涂阳样本经HAIN线性探针检测判定检测结果无效。故而排除以上7例患者,最终有380例涂阳结核病患者继续本次研究。***的平均样本TAT为(28.77±10.67)小时,而DST的平均样本TAT为(1508.87±153.97)小时。***对利福平(RIF)耐药性检测的敏感性为82.92%,特异度为96.12%;与DST符合率为94.68%,Kappa值为0.743。两种方法在检测RIF是否耐药有高度的一致性。***对异烟肼(INH)耐药性检测的敏感性为94.33%,特异度为94.12%;与DST符合率为94.14%,Kappa值为0.785。两种方法在判断INH是否耐药有高度的一致性。5.与传统DST比较,HAIN筛查MDR的敏感性为96.97%,特异度为97.96%,二者符合率为97.87%,Kappa值为0.877,两种方法在筛查MDR-TB方面具有非常高度的一致性。6.对确诊为MDR-TB的32例患者进行RIF耐药位点分析,发现本地区rpoB发生频率最高的情况是WT8和MUT3同时突变,即53033位点出现S531L突变,检出频率为56.25%;其次为WT7与MUT2同时突变,即52629位密码子发生H526Y突变,检出频率为15.68%;第三为WT3+WT4+MUT1同时突变即51319位点发生D516V突变,突变频率为9.38%。7.对确诊为MDR-TB的32例患者进行INH耐药位点分析,发现kat G基因总的突变频率为96.88%,inhA基因突变的总频率为37.50%。二者之间差异具有统计学意义(χ=22.12,P0.05)。可以认为katG基因突变频率高于inhA基因,katG基因有可能是导致本地区此次研究人群INH发生耐药的主要原因之一。结论HAIN线性探针技术在耐多药
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