胰岛素信号对不同基因型小鼠ADSCs成脂后去分化的影响

作     者：叶玲敏 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：潘杰

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：成脂细胞去分化 胰岛素信号通路 DFATCs OSI-906 

摘      要：迄今为止的国内外研究表明,从动物体内分离得到的内脏或皮下白色成熟脂肪细胞在无外源胰岛素的体外培养条件下,可自主发生去分化;而添加胰岛素则可维持其原有成熟表型、抑制其去分化。我推测胰岛素信号与脂肪细胞去分化存在相关性。然而胰岛素信号影响脂肪细胞去分化的分子机制尚不明了。本文采用形态学和分子细胞生物学检测手段,通过研究胰岛素信号对肥胖和非肥胖小鼠成脂细胞去分化的影响,进而对不同遗传背景小鼠的内脏白色脂肪细胞去分化机制进行初步探讨。本文选用7-8周龄的四种基因型(C57BL/6J遗传背景,WT、TNF-α-/-、Leprdb/db以及DT)雄性小鼠为实验材料。前两种小鼠为非肥胖小鼠,后两种为遗传性自发性肥胖小鼠。首先,使用经典的“鸡尾酒法,分别诱导上述不同基因型小鼠内脏原代白色脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外成脂分化为成熟脂肪细胞,然后,采用不同的方法处理细胞,令其去分化。共设三组:(1)单纯对照组,成脂诱导后10天后去除胰岛素,细胞继续培养于含有10%胎牛血清的完全生长培养基中(含有未知的微量胰岛素);(2)干预组,在去除胰岛素的同时添加胰岛素信号抑制剂(OSI-906,linstinib),细胞继续培养于含有10%胎牛血清的完全生长培养基中;(3)DMSO对照组,在去除胰岛素的同时添加OSI-906的溶剂(DMSO),细胞继续培养于含有10%胎牛血清的完全生长培养基中。三组细胞去分化实验开始后,在相应培养条件下,继续培养8天。此外,为了验证去分化的成脂细胞(dedifferentiated fat cells,DFATCs)是否重新获得干细胞特性,对其进行了成脂再分化和成骨转分化诱导实验。通过一般形态学和特殊染色方法,以及针对脂解、成脂、胰岛素信号通路和脂肪干细胞相关靶基因的转录和翻译水平的检测,探究胰岛素信号对不同基因型小鼠成脂细胞去分化的影响。结果如下:1.分离纯化WT小鼠ADSCs,以确定成脂分化、成脂后去分化以及DFATCs成脂再分化的检测时期。通过细胞形态变化特征确定了以下五个时期:成脂分化0天(D0)、10天(D10),成脂后去分化3天(DD3)、8天(DD8),DFATCs成脂再分化10天(RD10)。2.选用不同浓度(0、0.1、0.3和1μM)的胰岛素信号通路抑制剂(OSI-906)干预WT ADSCs成脂分化。通过细胞形态变化特征和靶蛋白表达水平的检测结果,确定了在胰岛素和血清均存在的条件下完全抑制胰岛素信号通路的最小药物(OSI-906)浓度。结果表明0.3μm最佳。3.形态学检测结果:(1)adscs成脂诱导10天后成功分化为成熟脂肪细胞;(2)成熟脂肪细胞随着去分化时间的延长逐渐发生去分化,dd8时完成去分化;(3)去分化速率为:干预组对照组,单纯对照组≈dmso对照组;(4)干预组和对照组的dfatcs成脂诱导10天后,再分化为成熟脂肪细胞,两组之间的成脂率无显著差异;(5)wt、tnf-α-/-、leprdb/db以及dt小鼠adscs的形态变化特征差异不大。***、tnf-α-/-、leprdb/db以及dt小鼠的对照组和干预组dfatcs获得前后的脂肪干细胞标志cd105表达持续上升;wtdfatcs成骨诱导21天后,茜素红钙结节染色结果为阳性,表明dfatcs重新获得干细胞特性。5.实时荧光定量rt-pcr(qpcr)检测结果显示:在小鼠成脂细胞去分化过程(dd0至dd8)中,胰岛素信号通路关键因子akt、glut-4的mrna表达水平无显著变化;成脂相关因子c/ebpα、pparγ、adiponectin和srebp-1的mrna表达水平持续下降;脂解关键因子atgl的mrna表达水平呈先升高后下降的趋势。单纯对照组、dmso对照组进行比较发现,两个对照组之间无显著差异。与对照组相比,osi-906干预组的atgl的mrna表达水平上调,c/ebpα、pparγ、adiponectin和srebp-1的mrna表达水平下调。另外,wt、tnf-α-/-、leprdb/db以及dt小鼠adscs的各检测分子在基因转录水平的表达变化趋势一致,主要差异在于各检测分子(同一时期和同一组)的相对表达量有所不同。***结果显示:在adscs成脂后去分化过程中(dd0至dd8),p-akt(thr308)的蛋白激活水平大幅下降,glut-4的蛋白表达水平呈先上升后下降的变化趋势,srebp-1和adiponectin的蛋白表达水平在去分化早期(dd3)已下降至检测极限。比较三组结果发现,单纯对照组和dmso对照组间无显著差异,osi-906干预组的p-akt(thr308)的蛋白激活水平极显著低于对照组。另外,wt、tnf