ASIC1a蛋白和polyQ扩展突变型ataxin-3蛋白表达量之间相互影响的研究

作     者：樊菲菲 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汤建光

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：ASICla ataxin-3 SCA3/MJD DMA 

摘      要：目的：在SCA3/MJD细胞模型中明确ASIC1a与ataxin-3蛋白表达量之间的相互影响,在细胞水平初步探讨ASIC1a在SCA3/MJD发病机制中的作用,以期为SCA3的发病机制及临床治疗研究提供新的线索。 方法： 1、将质粒pEGFP-N1-ataxin-3-20Q/70Q转染HEK293细胞,构建SCA3/MJD细胞模型。 2、调节细胞培养液分别为DMEM培养基(pH=7.4,以下简称DMEM培养基)、pH=7.4的缓冲液、pH=6.0的缓冲液,Western印迹检测ataxin-3蛋白的表达量,明确细胞培养液pH值改变是否影响ataxin-3蛋白的表达量。 3、在细胞培养液中依次加入不加和加入50μM、100μM、150μM的ASIC1a抑制剂盐酸阿米洛利(5-N,N-dimethyl amiloride, DMA), Western印迹检测ataxin-3蛋白的表达量,明确DMA对ataxin-3蛋白表达量的影响。 4、将质粒pCMV-HA-ASIC1a和pEGFP-N1-ataxin-3-20Q/70Q共转HEK293细胞,构建表达ASIC1a的SCA3/MJD细胞模型。通过调节细胞培养液pH值激活ASIC1a, Western印迹检测ataxin-3蛋白的表达量;在细胞培养液中加入不同浓度DMA, Western印迹检测ataxin-3蛋白的表达量,明确激活或抑制ASIC1a对ataxin-3蛋白表达量的影响。 5、将质粒pCMV-HA-ASIC1a和pEGFP-N1-ataxin-3-20Q/70Q共转HEK293细胞,Western印迹检测ASIC1a蛋白表达量,明确ataxin-3的polyQ扩展突变是否影响ASICla蛋白的表达量。 结果： 1、在单转仅表达ataxin-3蛋白的细胞(无ASICla蛋白表达)中：不同pH处理后的各组细胞之间,ataxin-3-20Q和ataxin-3-70Q的表达量在不同pH值组间均无明显差异;不同浓度DMA处理后的各组细胞之间,ataxin-3-20Q和ataxin-3-70Q的表达量亦无明显的组间差异。 2、在ASIC1a与ataxin-3蛋白共表达的细胞中：经过不同pH处理后的各组细胞之间,ataxin-3-20Q的表达量无明显的组间差异,pH=6.0组其ataxin-3-70Q的表达量明显高于另外两组细胞(P0.01);pH=6.0时,ataxin-3-70Q的表达量在加50μM的DMA组与不加DMA组间无明显差异,但加100μM和150μMDMA的两组其ataxin-3-70Q表达量均比不加DMA组明显减少(P0.05和P0.01)。 3. ASIC1a与ataxin-3共转细胞经不同pH处理后,ataxin-3-70Q组的ASIC1a表达量均较ataxin-3-20Q组高(P0.05)。 结论： 1、野生型ataxin-3蛋白和ASIC1a蛋白的表达量之间无相互影响。 2、ASIC1a在酸性环境中被激活后,可明显上调扩展突变型ataxin-3蛋白的表达量。 3、ASIC1a抑制剂DMA可逆转激活状态ASIC1a对扩展突变型ataxin-3蛋白表达量的影响。 4、扩展突变型的ataxin-3蛋白可上调ASIC1a的表达量。