大肠杆菌高产色氨酸菌株的构建

作     者：陈荣庆 

作者单位：浙江师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王欣

授予年度：2014年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：色氨酸 大肠杆菌 摇瓶发酵 

摘      要：色氨酸是一种重要的营养必需氨基酸。色氨酸主要存在三种异构体：L型,D型,DL型。L-色氨酸是人和动物体所必需的8种氨基酸之一,由于L-色氨酸只能够在绿色植物和微生物体内合成,人和动物体内的色氨酸摄取只能是从外界中的食物来获取。在这三种构型的色氨酸中,动物体内几乎不含有D-色氨酸,而且D-色氨酸也没有任何代谢作用,不过也没有毒性。所以目前有关色氨酸的研究主要是针对L-色氨酸的研究进展来进行的。随着色氨酸研究的越来越深入,其应用也逐步涉及到医药,食品,饲料添加剂等各个方面。 本研究以现有的大肠杆菌芳香族氨基酸代谢通路为理论基础基础,引入Red重组酶系统敲除大肠杆菌基因组上trpR基因,目的是解除了基因组上大肠杆菌内色氨酸合成过程中的反馈阻遏,调整色氨酸合成限制性步骤基因拷贝数量等方法,改造色氨酸合成过程中的调控网络,以期提高色氨酸的发酵水平。另一方面,将通过改造生产菌株底盘细菌色氨酸代谢通路入手,敲除底盘细菌色氨酸代谢通路的基因,重新构建表达色氨酸操纵子基因的质粒,在大肠杆菌体内高效表达。本文主要内容如下： (1)Red重组法构建trpR基因的缺失突变株。 色氨酸在大肠杆菌内的代谢过程的关键步骤在于中心途径之后的共同途径和分支途径。分支途径中所需要的酶主要由色氨酸操纵子基因来编码合成,其中trpE、trpD编码邻氨基苯甲酸合成酶(AS),此酶的活性主要受到反馈抑制的调控。大肠杆菌中,邻氨基苯甲酸合成酶是色氨酸合成过程中的关键酶之一,对活性的调控主要由trpR蛋白实现,当trpR蛋白表达并与色氨酸结合后,会转录阻遏色氨酸操纵子基因。所以理论上讲,如果敲除大肠杆菌基因组上的trpR基因,这样就能够解除色氨酸合成过程中的反馈抑制,从而达到提高色氨酸产量的目的。 (2)重新改造现有的质粒mc33。 现有质粒已将色氨酸操纵子trpABCDE串联表达,在此基础上,本研究构建重组质粒pSU18-trp operon和pUC19-serA/aroG,转化导入大肠杆菌,摇瓶发酵检测色氨酸发酵水平,15h左右最高产酸量可达0.1mg/L。 (3)建立合适的HPLC测定发酵液中L-色氨酸的方法。 测定L-色氨酸的传统方法主要有纸层析法、薄层分析法、比色法、高效液相色谱法、氨基酸分析仪测定法等。在实验室研究中最常用的方法主要是对二氨基苯甲醛法和柱前衍生HPLC法。但是这两种方法都有其局限性和不足之处。主要是因为此两种方法都需要浓硫酸作为显色剂,而且操作步骤复杂,实验危险性较大。另外其测量精度也不如HPLC法。所以目前在L-色氨酸含量测定研究中人们已经逐步采用HPLC法来替代这两种方法。因为在紫外光区278nm处L-色氨酸有特异性光吸收,HPLC法测定色氨酸含量的理论依据是利用光电二极管阵列(DAD)检测器来检测在此波长下吸收峰的面积变化来确定L-色氨酸的含量。本次研究采取的HPLC运行条件：以SunFireTM18柱(5μm,150mm×4.6mm)为分离柱,流动相比例是V(0.03%KH2PO4溶液)：V(甲醇)=90：10,流量为1mL/min,在278nm处检测-色氨酸。柱温39℃,进样量20ul。 4、对工厂提供原始菌株质粒mc33测序结果以及原始菌株基因组扫描框架图的分析。根据和工厂签订的保密协议,该部分结果没有放在本论文中。