电针通过α7nAChR调控小胶质细胞活化状态诱导脑缺血耐受的机制研究

作     者：马治 

作者单位：第四军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王强

授予年度：2017年

学科分类：1005[医学-中医学] 100512[医学-针灸推拿学] 10[医学] 

主      题：脑缺血再灌注损伤 电针预处理 α7nAChR 小胶质细胞 

摘      要：脑卒中是世界范围内第五大致死性病因,致死致残率高,严重的影响了人们的生活,并且对家庭和社会造成了极大的经济负担。尽管目前已经有了大量关于脑卒中发病机制的研究,真正行之有效的临床治疗手段还是极度缺乏。因此,急需一种能够有效防治脑卒中的新方法。脑卒中主要以缺血性脑卒中为主,占了全部脑卒中的80%以上,主要动脉的阻塞造成了缺血部位能量和氧气缺失,引起细胞坏死崩解,坏死细胞释放大量危险信号导致大脑炎症反应的发生。剧烈的炎症反应是造成大脑继发性损伤的重要原因。然而,也有研究表明,抑制脑卒中后的神经炎症将会影响长期大脑功能的恢复。因此,如何精确的调控脑卒中后的神经炎症将为脑卒中的治疗带来新曙光。小胶质细胞是脑内免疫效应细胞,作为中枢神经系统对抗外界损伤性刺激的第一道防线,小胶质细胞的存在对于大脑具有非同寻常的意义。大脑发生炎症反应之后,常常伴随着小胶质细胞的激活。由于各种不同的刺激和外界环境的改变,小胶质细胞可以激活为经典激活状态(M1型)发挥促炎作用,通常主要活跃在脑缺血损伤后早期,加剧组织损伤;也可以激活为选择性激活状态(M2型)发挥抗炎作用,主要在脑缺血损伤后晚期发挥作用,促进损伤组织修复。既然小胶质细胞不同的表型发挥不同的作用,那么,从神经保护的角度出发,通过调控小胶质细胞的活化状态,进而减少具有神经毒性的小胶质细胞M1型表达,增加神经保护作用的小胶质细胞M2型表达对于防治脑缺血损伤具有重要意义。胆碱能抗炎通路通过神经系统与免疫系统相互作用抑制炎症反应,其中烟碱型乙酰胆碱受体α7亚单位(α7n ACh R)在抗炎过程中发挥着重要作用。α7n ACh R广泛表达于神经元与各种非神经元细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞等)表面。研究表明,激活小胶质细胞和巨噬细胞膜表面的α7n ACh R可以抑制炎症反应,并且发挥神经保护作用。我们课题组的前期研究发现,电针预处理可以有效地减轻脑缺血损伤,然而,其具体机制尚未完全阐明。那么,电针能否通过α7n ACh R影响小胶质细胞的激活状态,使其由促炎表型向抗炎表型转化,从而发挥脑保护作用呢?为此,我们设计了如下研究。实验一:电针预处理调控脑缺血再灌注后小胶质细胞的活化状态目的:观察电针预处理是否会改变脑缺血半暗带内小胶质细胞的活化状态方法:将实验动物随机分成3组:假手术组(Sham)、脑缺血再灌注组(MCAO)、电针预处理组(EA+MCAO)。缺血再灌注3天后将动物处死,取其脑组织缺血半暗带,通过Western Blot技术检测各组M1/M2型小胶质细胞标识分子的表达水平。结果:Western Blot检测结果表明,与MCAO组比较,EA+MCAO组M1型小胶质细胞标识分子i NOS和IL-1β表达降低(P0.05,***),M2型小胶质细胞标识分子Arginase和TGF-β表达升高(P0.05,***)。结论:电针预处理能改变脑缺血再灌注后半暗带内小胶质细胞的激活状态,使小胶质细胞由M1型向M2型转化。实验二:α7n ACh R参与电针预处理对脑缺血半暗带内小胶质细胞活化状态的调控目的:通过实验一我们发现电针预处理能减少脑缺血再灌注后半暗带内M1型小胶质细胞特异性标识分子的表达,增加M2型小胶质细胞特异性标识分子的表达,那么电针是通过什么机制造成了小胶质细胞活化状态的改变呢?α7n ACh R在神经炎症中发挥着重要的作用,本实验的主要目的是观察电针预处理是否可以调控α7n ACh R影响小胶质细胞的活化状态。方法:1.α7n ACh R激动剂PHA-543,613对脑缺血再灌注后小胶质细胞活化状态的影响将实验动物随机分为5组:假手术组(Sham)、脑缺血再灌注组(MCAO)、α7n ACh R激动剂组(PHA-543,613+MCAO)、溶剂组(Vehicle+MCAO)、电针预处理组(EA+MCAO)。脑缺血再灌注后3天取半暗带组织,通过Western Blot技术检测M1/M2型小胶质细胞特异性标识分子的表达水平。2.α7n ACh R抑制剂α-BGT对脑缺血再灌注后小胶质细胞活化状态的影响将实验动物随机分为5组:假手术组(Sham)、脑缺血再灌注组(MCAO)、电针预处理组(EA+MCAO)、α7n ACh R抑制剂组(α-BGT+EA+MCAO)、溶剂组(Vehicle+EA+MCAO)。脑缺血再灌注3天后取半暗带组织,通过Western Blot技术和免疫荧光技术检测M1/M2型小胶质细胞特异性标识分子的表达水平。结果:1.与MCAO组比较,PHA-543,613+MCAO组和EA+MCAO组的i NOS和IL-1β表达均减少,Arginase和TGF-β表达均增加(P0.05,***)。Vehicle+MCAO组与MCAO组之间并无