家蚕低分子量热激蛋白的基因组学分析与HSP20.8A的表达及FISH研究

作     者：孙卫忠 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王彦文;李斌;鲁成

授予年度：2004年

学科分类：090504[农学-特种经济动物饲养（含：蚕、蜂等）] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：家蚕 sHSP 同源检索 EST 系统进化重组表达 染色体荧光原位杂交 

摘      要：家蚕是重要的经济昆虫,人们利用家蚕已经有五千多年的历史。同时, 家蚕也是用于科学研究的模式生物之一。2002 年 10 月家蚕 10 万条 EST 数据库的构建及 2003 年 11 月家蚕基因组框架图的相继完成,不仅对于蚕 业科学研究及蚕业生产具有重大意义,而且对于生命科学的研究也具有重 要的促进作用。低分子量热激蛋白(small heat shock protein, sHSP)是一 种普遍存在的蛋白,广泛存在于生物界,不但在生物体受到各种理化刺激 作用下表达,在生物体的正常生长发育过程中也有表达。因其在序列上具 有较高的保守性,是用做进化分析,探索物种系统演化的重要基因之一。 为了系统地了解 sHSP 基因在家蚕中的分布特点、基因结构、表达时间特 异性、表达组织特异性、基因位置特异性等多方面信息。本研究对家蚕基 因组数据库进行同源检索,同时对已报道家蚕低分子量热激蛋白 HSP20.8A 进行克隆表达及荧光原位杂交研究。实验结果如下: 1 家蚕 sHSP 的数量及基因结构 利用来自人类 10 种、鼠 8 种、果蝇 11 种及已知家蚕的 6 种 sHSP 序 列在家蚕基因组中进行同源性检索。一共得到 14 个 sHSP 基因,6 个与已 知的序列相同,8 个为新发现基因。14 个 sHSP 基因中,有 3 个基因含有 内含子结构:其中 Bmb018979mb18980 基因含有 4 个内含子,其余两 个基因(Bmb007190 和 Bmb026351)各有两个内含子。分析结果表明所 有基因编码的蛋白质在二级结构上具有共同结构域,即均含有一个 N-端 的可变区、一个α-晶体结构的保守区和一个较短的 C-端可变区。α-晶体 保守区长度约 60～90 个氨基酸。 2 家蚕 sHSP 基因的串联重复现象 根据 sHSP 基因在家蚕基因组序列中的分布位置,发现有 8 个基因分 别位于 3 个 scaffold 内,表现出串联重复的特点,同一 scaffold 中的 sHSP 相邻基因间无其它结构基因存在。根据基因在 scaffold 中的预测方向,发 现每个 scaffold 中含有的基因序列方向两两相对,这种现象在其它物种中 未见报道。 3 家蚕 sHSP 基因表达 EST 证据 利用预测的sHSP 基因的CDS 序列与家蚕 EST数据库进行同源检索, - 1 - 家蚕低分子量热激蛋白的基因组学分析与 HSP20.8A 的表达及 FISH 研究 结果发现除 1 个基因(Bmb036757)未发现 EST 证据外,其余 13 个基因 在家蚕的正常生长发育时期均有表达。但不同基因在不同的表达时期和表 达部位其表达量不同。基因 Bmb002839 发现的 EST 最多,有 250 条。其 次为 Bmb018979mb018980 和 Bmb002837,分别为 159 条和 77 条。在 不同的组织器官中 sHSP 基因的表达量有所不同,其中在未受精卵中表达 量最多,共有 295 条,在精巢、卵巢、丝腺及脂肪体中表达量在 53～71 条之间。同一组织器官中,不同 sHSP 的表达量也有所差异。在表达量最 多的未受精卵中,基因 Bmb002839 发现的 EST 数目最多,有 219 条,占 总表达量的 74%。 4 家蚕 sHSP 系统进化分析 对 14 种家蚕 sHSP、人类的 10 种 sHSP 及果蝇的 11 种 sHSP 基因编码 的α-晶体保守区进行系统进化分析显示:低分子量热激蛋白在 3 个物种 中存在 3 个主要分支即人类、果蝇、家蚕,表现出各个物种的 sHSP 基因 具有独立进化的方式。同时,三个物种之间存在相互交叉的分支。 5 HSP20.8A 的克隆与表达 根据已公布的 HSP20.8A 的 cDNA 序列设计引物,从家蚕基因组中钓 取基因序列构建测序载体。经测序证明该基因无内含子序列,最长开放阅 读框为 561bp,共编码 186 个氨基酸残基。将此基因序列两端用限制性内 切酶酶切后构建表达转移载体,然后与线性化杆状病毒共感染草地贪夜蛾 细胞系 sf21,对表达的重组蛋白进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,其 分子量大小约 20kDa。 6 HSP20.8A 基因的染色体荧光原位杂交 利用随机标记法对 HSP20.8A 进行地高辛荧光标记,构建杂交探针。 与家蚕生殖腺染色体进行荧光原位杂交,杂交点均在染色体近中部区域。 且杂交信号只有一个,说明该基因在家蚕基因组中为单拷贝基因。根据各 个时期产生的杂交信号来看,细胞间期染色体比较容易获得杂交信号,而 中期染色体及粗线期染色体较难获得杂交信号。