凋亡相关蛋白POTE在晚期非小细胞肺癌顺铂耐药中的功能研究

作     者：陈秀 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周彩存

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：晚期非小细胞肺癌 顺铂耐药 POTE-2γ 凋亡相关蛋白 肿瘤标记物 

摘      要：研究背景 肺癌是目前全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一。在我国，肺癌的发病率在逐年上升，并且已经成为我国城市人口癌症死亡的主要原因。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌的主要病理类型，占80%左右。由于早期肺癌缺乏特异性症状，65%-70%的NSCLC患者确诊时已处于晚期，失去手术治疗的机会。晚期肺癌治疗一般采取多学科综合治疗，其中化疗是最重要手段之一。自80年代以来，随着第三代化疗药物不断涌现，以铂类为基础联合第三代化疗新药的方案成为晚期NSCLC的标准化疗（Standard Chemotherapy, SC）方案，但其化疗的有效率（Response Rate, RR）仅为30%-40%，NSCLC的5年生存率仅为15%。而造成化疗失败的主要原因是耐药。 一直以来，顺铂被认为是晚期NSCLC化疗的基石，几乎所有一线NSCLC化疗方案都是与顺铂联合应用的方案。顺铂的抗癌作用机制是药物进入肿瘤细胞后，与DNA交叉连接，形成稳定的顺铂-DNA复合物，阻断DNA复制，导致肿瘤细胞死亡。当前认为导致顺铂耐药的机制包括肿瘤细胞内药物浓度降低、药物在细胞内被降解代谢以及DNA损伤修复增强。除此之外，还包括凋亡信号转导通路的改变。顺铂抗肿瘤作用的主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡。体内外研究发现，肿瘤细胞凋亡发生改变主要由于细胞凋亡信号转导通路异常，凋亡相关因子表达异常引起。 POTE基因家族是灵长类生物所特有的，包含13个高度同源的基因亚型，分别位于8条不同的染色体上。在多种肿瘤组织（前列腺癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌和胰腺癌）及生殖细胞中表达，但在正常组织中不表达。在肿瘤组织中高表达的主要亚型是POTE-2γ和POTE-2α。目前POTE的功能尚不明确。有研究在Hela细胞及精子细胞中发现，POTE可能与Fas/FasL、BAK、Casepase-3等凋亡相关蛋白相互作用，与凋亡信号相关。本实验室前期运用二维凝胶电泳及质谱分析的方法，在A549（人肺腺癌细胞珠）和A549/DDP（顺铂诱导的耐药细胞株）中分析差异性蛋白时发现：POTE蛋白在A549/DDP细胞株中表达明显低于A549细胞。本研究旨在筛选出在A549细胞中起主导作用的POTE亚型，并分析其在A549细胞和A549/DDP细胞中的表达差异。收集应用含铂双药治疗的临床样本（肿瘤组织），初步分析POTE表达变化与NSCLC患者化疗疗效之间的关系。本研究共分三部分进行： 第一部分:A549/DDP耐药株建立及生物学行为鉴定 【目的】A549细胞株基础上诱导的A549/DDP细胞株的建立及其生物学行为的鉴定。 【方法】采用顺铂敏感人肺腺癌细胞株A549经顺铂诱导产生对顺铂耐药的耐药细胞株A549/DDP;MTT法检测两细胞株对顺铂的敏感性。 【结果】 1.人肺腺癌敏感细胞株A549顺铂诱导产生耐药的细胞株A549/DDP。 2. MMT法检测结果显示顺铂对A549和A549/DDP细胞的增殖均有抑制作用，顺铂对 A549和A549/DDP细胞的IC50值分别为5.6和42.6ug/ml，耐药倍数为7.57倍。 【结论】 成功获得了人非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP，明确耐药细胞株的耐药指数为7.57倍。 第二部分POTE蛋白在A549细胞中主要的表达亚型及其在铂类耐药中的作用和机制 【目的】本部分实验旨在筛选出A549细胞中POTE主要表达的亚型，明确其在A549和A549/DDP细胞中分子水平和蛋白水平的表达差异，探讨POTE-2γ与凋亡相关因子（Fas、Bax、Bak、Caspase-3）的关系。 【材料和方法】1.运用Trizol提取A549细胞中的总RNA;2.运用PCR产物克隆筛选的方法，筛选出62个菌落测序;3.运用DNAstar软件进行碱基比对;4.应用蛋白印迹法（Western Blot, WB）验证POTE-2γ在A549和A549/DDP细胞中的表达差异;5.运用蛋白印迹的方法分别检测顺铂在不同时间和浓度梯度时，A549及A549/DDP两细胞株中POTE-2γ及凋亡相关因子（Fas、Bax、Bak、Caspase-3）表达量的变化;6.构建慢病毒载体,感染A549细胞，下调POTE-2γ表达，蛋白印迹检测目标蛋白（Fas、Bax、Bak）表达变化。 【结果】 1.PCR克隆筛选出的62个菌落中，其中4个测序失败，58个完成测序。完成测序的58个序列通过碱基比对均为POTE-2γ。 2.慢病毒对A549细胞中POTE-2γ表达量的干扰效率约73.6%。 3.蛋白印迹法及免疫细胞化学验证结果显示POTE-2γ在A549及A549/DDP两细胞株间存在表达差异。 4.蛋白印迹结果显示顺铂在不同时间和浓度梯度POTE-2γ在A549及A549/DDP两细胞株间存在表达差异。 5.在A549细胞中下调POTE-2γ的表达，凋亡相关蛋白（Fas、Bax、Bak）表达的表达量也相应下调。 【结论】 1.在A549细胞中主要表达的POTE亚型是POTE-2γ。 2. POTE-2γ在A549细胞中的表达量明显高于A549/DDP细胞。 3. POTE-2γ可能通过上调Fas等促凋亡因子，下调Bax，Bak等抗凋亡受体发挥促凋亡作用，而与顺铂耐药相关。 第三部分NSCLC患者组织中POTE-2γ表达水平与含铂双药化疗疗效的相关性 【目的】探讨POTE-2γ表达与晚期NSCLC患者一线使用含铂双药方案治疗的疗效的关系。【材料和方法】 1.收集接受一线含铂双药治疗的晚期NSCLC患者的肿瘤组织;2.采用Trizol法提取组织中的总RNA;3.采用Fermentas RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit逆转录;4.采用实时荧光定量PCR检测组织中POTE-2γ的表达量;5.运用SPSS软件分析数据。 【结果】 1. POTE-2γ高表达的患者一线使用含铂双药方案的疗效优于低表达者，且与患者的性别相关（P=0.003）;2. POTE-2γ高表达的患者TTP（Time To Progress）和OS（Over Servival）均长于POTE-2γ低表达的患者。 【结论】 POTE-2γ可能可以作为晚期NSCLC患者一线使用含铂双药方案化疗疗效的预测因子，但需要大样本前瞻性的研究加以验证。