中国林蛙皮肤活性多肽基因表达的多样性研究

作     者：白冰 

作者单位：辽宁师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：尚德静

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：中国林蛙 抗菌肽 缓激肽 预测 多样性 

摘      要：生物活性肽是从动、植物等天然产物中以及微生物中分离出来的肽段,这些肽段可以是只有2个氨基酸组成的双肽,也可以是复杂的长链和环状多肽。生物活性肽按照功能可分为生理活性肽以及其它生物活性肽,其中生理活性肽包括抗菌肽,抗病毒多肽,神经活性肽,激素以及激素调节肽,免疫活性肽等等。由于人工化学合成或从天然产物中分离生物活性多肽成本高,价格昂贵,实际应用中存在许多困难,这就需要对活性多肽的物理化学性质,基因结构及表达情况等基础性问题进行深入的研究。 中国林蛙(Rana chensinensis)是欧洲林蛙的中国亚种,其皮肤中含有大量丰富的生物活性肽。本研究根据蛙类Rana属中抗菌肽的信号肽末端的保守序列设计简并引物,并且利用RT-PCR技术从单个中国林蛙皮肤中共克隆得到196条cDNA序列,其中有173条为有义cDNA序列,共编码了35条不同的抗菌肽前体和23条不同的成熟肽,1条缓激肽前体和一些特殊的活性多肽序列。这点充分说明中国林蛙个体中活性多肽基因表达具有多样性的特点。其活性多肽前体的氨基酸序列呈现一定的规律性,信号肽区和酸性前肽区序列较保守,而成熟肽区域的氨基酸序列差异性较大。根据生物活性多肽中成熟肽序列差异可将这些多肽分为8个不同的抗菌肽家族和2个缓激肽。抗菌肽家族分别为temporin-1,brevinin-1,brevinin-2,chensinin-1, chensinin-2, chensinin-3, chensinin-4和chensinin-5家族,缓激肽分别为Bradykinin和Thr-BK。 利用生物信息学软件分析得到,8个家族的抗菌肽都呈阳离子性,理论等电点在5.76～10.07之间,分子量在1460.8～3702.4,一般由13～37个氨基酸残基组成。通过抗菌肽库网站的比对,发现中国林蛙皮肤中的大部分抗菌肽与库中已有的抗菌肽相似性达到70%以上,而抗菌肽brevinin-1CEf和brevinin-1CEf分别与西藏高原中的高山倭蛙(Nanorana parkeri)相似度为58.82%和50%。在二级结构分析中,除brevinin-1CEc,brevinin-1CEb和chensinin-2不具有α-螺旋区域,而是以含有延伸链为主,其余大部分抗菌肽都含有一段α-螺旋区域。 从活性多肽的种类分析,中国林蛙皮肤中含有多种具有研究价值的生物活性肽,包括抗菌肽和缓激肽等。从活性多肽的基因和氨基酸序列分析,抗菌肽的序列高度同源,但成熟肽序列变异较大,其二级结构也存在着差异,这点决定了活性多肽在种类,结构,功能等方面具有多样性。