云斑天牛Minus-C OBPs与配基的结合与释放机制

作     者：郑志川 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王满囷

授予年度：2017年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：云斑天牛 气味结合蛋白 荧光竞争结合 同源建模 分子对接 定点突变 

摘      要：云斑天牛Batocera horsfieldi(Hope),又名云斑白条天牛,在我国分布广泛,是林业上重要的蛀干害虫,其灵敏的嗅觉系统在寄主定位、交配和产卵等方面发挥着重要的作用。而昆虫的气味结合蛋白(OBPs)可以携带环境中的疏水性气味分子到达气味受体,在特异性识别信息化学物质的过程中起着重要的功能。若能明确云斑天牛气味结合蛋白与配体分子的结合与释放机制,可为其行为调节剂的研究提供重要的理论依据。为此,本课题以云斑天牛为研究对象,测定了Bhor OBPs与17种寄主挥发物的荧光竞争结合特性,并利用计算机进行同源模建和分子对接,配合氨基酸定点突变技术,分析了Bhor OBPm2的结构特点及其与配体分子的结合与释放机制。主要研究结果如下:1.云斑天牛Minus-C OBPs基因克隆、蛋白表达和纯化成功构建重组质粒p GEX-6P-1-Bhor OBPm1,p ET30a-Bhor OBPm2和p ET17bBhor OBPm4。p GEX-6P-1-Bhor OBPm1在上清中表达,通过GST 4B亲和层析柱获得Bhor OBPm1的纯蛋白;p ET30a-Bhor OBPm2和p ET17b-Bhor OBPm4在包涵体中表达,分别通过Ni离子亲和层析柱及DE52弱阴离子交换柱在体外成功获得Bhor OBPm2和Bhor OBPm4的纯蛋白。2.云斑天牛Minus-C OBPs结合特性分析以1-NPN为荧光探针分别测定了云斑天牛3个Minus-C OBPs与寄主挥发物在酸性和中性环境下的结合能力。Bhor OBPm1在中性环境下与水杨醛有较弱的结合能力,在酸性环境下与马鞭草烯酮有较强结合能力;Bhor OBPm2在中性环境与己醛、反-2-己烯醛以及反-2-己烯醇有较强的结合能力,在酸性条件下仅与反-2-己烯醇、己醛和2-甲基丁醛表现出较弱的结合能力;Bhor OBPm4在中性环境下与所有挥发物都无结合能力,在酸性环境下,仅与柠檬烯氧化物、水杨醛和顺-3-己烯醇表现出较弱的结合能力。3.云斑天牛Bhor OBPm2同源建模与分子对接以同源蛋白Agam OBP1(2ERB)为模板,建模得到Bhor OBPm2的三维结构,其具有六个α螺旋,两个二硫键,属于Minus-C OBPs家族。与模板蛋白Agam OBP1(2ERB)的C端结构相似,Bhor OBPm2的C末端的氨基酸残基Phe123与Tyr50形成氢键,将C端固定在结合腔的表面。Bhor OBPm2与56种气味物质对接结果显示,六个α螺旋在Bhor OBPm2的中心形成了一个疏水性的结合腔,且在结合腔的表面形成了两个大小不同的开口。结合腔的表面大部分为疏水性区域,配体小分子主要以疏水作用力固定在腔内,而C端氨基酸残基Ile121和Phe123形成了结合腔表面唯一的极性区域。*** OBPm2的氨基酸定点突变及结合验证荧光竞争结合试验结果表明,Bhor OBPm2特异性选择链状配基,且基于碳链的长度进行选择;Bhor OBPm2与配基的结合能力受p H的影响,中性环境下的结合能力明显强于酸性环境。将Bhor OBPm2与其他OBPs进行比较,我们发现属于Minus-C OBPs家族的Bhor OBPm2与属于Classical OBPs家族的Agam OBP1、Cqui OBP1和Aaeg OBP1具有相似的结合腔结构以及配基选择取向,但由于缺失一个二硫键,Bhor OBPm2拥有更大的结合腔和更广泛的配基选择。因此我们猜测Bhor OBPm2可能是OBPs进化过程中的中间体结构。为探究Bhor OBPm2 C端的作用,我们设计了两个Bhor OBPm2的突变体C-ter113和Y50F。通过对突变体蛋白的研究发现,Bhor OBPm2的C端在配基释放的过程中并非如前人报道的起到了“盖子作用。