高通量测序检测榕小蜂COI基因异质性及其对分子鉴定的影响

作     者：王彦坤 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄大卫

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：线粒体 异质性 高通量测序 生物信息学分析 DNA barcoding 

摘      要：背景:线粒体异质性是指在一个个体内,存在多种线粒体单体型的现象。目前关于线粒体异质性的研究,主要集中在与人类疾病、年龄以及组织特异性的领域。在昆虫中有关线粒体异质性的研究比较少,主要研究焦点则聚焦在线粒体异质性状态,异质性的来源。然而很少有人关注线粒体异质性对分子鉴定的影响。方法:本实验以寄生于对叶榕的Ceratosolen solms（Agaonidae/Kradibiinae）,Apocrypta bakeri（Pteromalidae/Sycoryctinae）,Philotrypesis pilosa（Pteromalidae/Sycoryctinae）,Philotrypesis sp.,及寄生于垂叶榕的Eupristina koningsbergeri（Agaonidae/Agaoninae）,Philotrypesis sp.1,Philotrypesis sp.3,Philotrypesis sp.4,Philotrypesis sp.5,Walkerella benjamini（Pteromalidae/Otitesellinae）,Walkerella sp.1,Sycophila sp.1（Eurytomidae/Eurytominae）,Sycophila sp.2,Sycobia sp.2（Pteromalidae/Epichrysomallinae）,Sycoscapter sp.1（Pteromalidae/Sycoryctinae）,Acophila sp.1（Pteromalidae/Epichrysomallinae）,Ormyrus sp.1（Ormyridae/Ormyrus）为实验材料,研究了不同物种的线粒体COI基因异质性情况。新一代测序技术的出现,为生命科学的研究提供了极大的帮助,并将生命科学带入大数据时代。在研究线粒体异质性方面,新一代测序技术有着常规实验途径所不具备的巨大优势:检测低频异质性。我们通过罗氏公司的454测序平台,结合mothur,Ultratranseq,Perl,CD-HIT等高通量数据分析软件,对榕小蜂的线粒体COI基因进行了大数据分析。通过生物信息学分析,得到以下主要结果:1)榕小蜂中,线粒体异质性现象十分普遍。我们检测到92.3%的个体内具有异质性,覆盖100%的实验物种。2)传粉榕小蜂的线粒体异质性水平较低,不足以干扰分子鉴定的准确性。尤其是在Ceratosolen solmsi中,4个个体中仅有1个个体检测到线粒体异质性,而其他3个个体各自所获得COI序列完全一致,这说明Ceratosolen solmsi中存在微乎其微的线粒体异质性。3)在具雄性多型现象的物种中,异质性情况因物种而不同。Philotrypesis属与Walkerella属的不同个体在两方面体现出高水平的线粒体异质性:1、次要单体型与主要单体型的K2P遗传距离大（甚至同一个体的COI片段汇聚类到不同的进化支上）;2、次要单体型所占比例高（次要单体型甚至占总序列数的71.8%）。尤其发现不同物种共享同一单体型,因而在使用COI对这两个属的物种进行分子鉴定时,需要格外小心。在Sycobia sp.2中,虽然次要单体型所占比例较小,但是由于次要单体型与主要单体型之间的遗传距离较大,因而也不能忽视次要单体型对分子鉴定的影响。在Sycophila sp.1和Sycophila sp.2中,所发现的异质性水平很低,COI片段可以很好地用于区分两个物种。4)在Apocrypta bakeri、Acophila sp.1、Sycoscapter sp.1与Ormyrus sp.1四个物种中,情况也因物种不同而有差异。由于Acophila sp.1所得序列较少,难以得出可靠结果。在Apocrypta bakeri中,发现次要单体型所占比例以及其余主要单体型的遗传距离均比较小,不会对分子鉴定产生重要影响。Sycoscapter sp.1中虽然具有比较高的次要单体型比例,但是其与主要单体型的遗传距离不大,不会对分子鉴定等产生影响。在Ormyrus sp.1中,次要单体型与主要单体型的K2P遗传距离大,并且次要单体型所占比例高,因而在使用COI片段对该物种进行分子鉴定需要留意。