粉纹夜蛾新细胞系的建立及其特性研究

作     者：孟敏娟 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李国勋

授予年度：2008年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：粉纹夜蛾 细胞系 QB-Tn9-4s RAPD-PCR 病毒产量 蛋白表达 

摘      要：昆虫细胞作为生物农药和基因表达的新型生物反应器而备受青睐。因此,不断发掘新昆虫细胞系,为科学研究和生产提供新资源,是目前研究的热点。 本研究以粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)受精卵为材料,建立多株粉纹夜蛾胚胎细胞系,从中筛选了一株悬浮的群体倍增时间短的,高产昆虫杆状病毒和外源蛋白的昆虫细胞系,命名为QB-Tn9-4s。 QB-Tn9-4s细胞在辅以10%小牛血清的TNM-FH培养基中原代培养80多天开始分裂细胞。开始细胞生长慢,并且不稳定,10天左右传代一次,细胞稳定后3～4天传代一次,现已传代60多代。 QB-Tn9-4s细胞形态70%为纺锤形,大小为18.22×57.70μm,30%为圆形,半径22.19μm。该细胞原代培养时是贴壁生长的,开始传代培养时贴壁性较弱,细胞稳定传代培养后呈悬浮生长且增殖很快,群体倍增时间为25.4小时,最大生长密度可达2.0×10～6cells/mL。 对苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopol-yhedrosisvirus,AcMNPV)、甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mamestra brassica NPV,MbNPV)、粘虫核型多角体病毒(Mythimna separata NPV,MsNPV)等病毒敏感。接种AcMNPV病毒,96小时病毒感染率达92%,多角体产量平均为(107.2±4.5)OBs/cell,是一株高产杆状病毒的细胞系。 通过随机扩增DNA-聚合酶链式反应实验,用引物OPU-09,OPU-10,N0.2,***鉴定,细胞系QB-Tn9-4s的基因组DNA与粉纹夜蛾卵基因组DNA,Tn5B1-4细胞基因组DNA的条带一致,与Sf-9细胞基因组DNA条带明显不同,说明细胞系QB-Tn9-4s是一株来源于粉纹夜蛾胚胎细胞的细胞系,并且该细胞与实验室保存的其它细胞没有交叉污染。 QB-Tn9-4s是一株高表达重组蛋白的昆虫细胞系。用重组病毒AcMNPV-β-gal侵染细胞,QB-Tn9-4s细胞内β-半乳糖苷酶的产量与Tn5B1-4相当,而远高于Sf-9,第8天达到最大表达量(2.53±0.034)×10～4IU/mL是Sf-9的1.98倍。随着时间的延长,QB-Tn9-4s培养基中酶量逐渐增加,第八天时QB-Tn9-4s细胞内和培养基中的酶总的表达水平达到(3.97±0.13)×10～4IU/mL。AcMNPV-SEAP感染该细胞,其细胞内的分泌型碱基性磷酸酶表达量水平明显的低于培养基中的表达水平,最高只达0.8 IU/mL。QB-Tn9-4s感染重组蛋白碱性磷酸酶总的表达水平与Tn5B1-4相当,第9天达到最大表达量(3.52±0.4)IU/mL,但是始终高于Sf-9,并且第9天表达量是Sf-9的2.32倍。