黄牛脂联素基因遗传特性及在大肠杆菌中的表达研究

作     者：张良志 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈宏

授予年度：2008年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0905[农学-畜牧学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：牛 脂联素基因 多态性 序列分析 克隆表达 

摘      要：本研究采用PCR-SSCP和DNA测序技术,检测了南阳牛、秦川牛、郏县红牛、晋南牛、中国荷斯坦牛5个群体的脂联素基因(Acrp30)的遗传变异,分析了其遗传结构和遗传多样性,并对南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个群体该基因的多态基因座与其生长性状进行了关联分析,以检验该基因的多态基因型对3个黄牛群体生长发育的遗传效应,以期发现对重要经济性状具有显著效应的遗传标记,为中国黄牛的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保存与利用提供遗传学依据。此外,对秦川牛脂联素基因进行了体外克隆、表达研究,为进一步的功能研究奠定了基础。本研究获得了以下结果: 1.脂联素基因多态性及其与南阳牛、秦川牛、郏县红牛生长性状的关联分析 共研究了5个群体的6个基因座。在内含子2新发现2个SNP(+822 CT和+866 CT,以起始密码子ATG中的A作为+1来定义序列的相对位置,下同),3’侧翼区新发现1个SNP。5个牛群体Hardy-Weinberg平衡检验结果表明,内含子2上的SNP位点处于非平衡状态。多态信息含量分析结果表明,除内含子2(+822 CT)为中度多态外,其它位点均为低度多态。基因型分布的卡方独立性检验显示,在内含子2基因型分布差异比较大,各品种间均差异极显著(PT、-10171 CT、-10007 GC、-9886 CT、-9936 CG)以及1处插入突变(-9940-9939 ins 67bp)。在P3基因座(-10598--11080)新发现1个点突变(-10997 CT)以及1处缺失突变(-10744--10740 delGATTA)。对P1和P3基因座的插入和缺失基因型分布的卡方独立性检验显示,奶牛与检测的地方黄牛存在显著差异(P0.05),但各群体在两个位点的PIC均小于0.20。通过对启动子区的转录因子结合位点的分析发现,在P1基因座存在一个固醇调节元件相关蛋白(SREBP)结合位点,两个过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)的结合位点以及一个碳水化合物反应元件(ChRE)。在P3基因座存在两个增强子结合蛋白(C/EBP)的结合位点及过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)的结合位点。通过序列分析发现,P1位点的插入序列实际上造成了一个可变拷贝,在这个插入序列中包含了一个碳水化合物反应元件(ChRE),而P3位点的缺失突变则导致一个增强子结合蛋白(C/EBP)结合位点的产生。 3秦川牛脂联素基因的克隆、表达 本试验利用Overlap-PCR技术首次扩增获得秦川牛脂联素基因全长CDS序列。脂联素基因编码区全长为723 bp,与GenBank公布序列的同源性为100%。将得到的脂联素基因CDS区导入到pET32a(+)表达载体骨架上,构建了脂联素基因大肠杆菌高效表达载体pAcrp-32,并得到了His-Acrp融合蛋白,大小为44kD(a包含表达的标签蛋白)。可溶性分析该融合蛋白以包涵体形式存在。并利用his-trap亲和层析柱对脂联素融合蛋白进行了纯化,为进一步的功能研究打下了基础。