小鼠和兔种间体细胞核移植研究

作     者：张玉影 

作者单位：华南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李雪峰

授予年度：2007年

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：胎儿成纤维细胞 种间体细胞核移植 小鼠 兔 

摘      要：本研究在建立了小鼠(兔)卵母细胞去核、激活及电融合法构建小鼠-兔(兔-小鼠)种间体细胞核移植胚胎等方法的基础上，以供体细胞的培养和处理以及重组胚的激活为重点研究了小鼠-兔以及兔-小鼠种间体细胞核移植胚的早期发育。 实验研究一：本实验以兔胎儿成纤维细胞为供体，去核小鼠卵母细胞为受体进行兔-小鼠种间核移植研究，结果如下： 1．比较了几种不同化学激活方法对小鼠卵母细胞激活的影响，结果表明，在10mM Sr内培养4h能有效地激活小鼠卵母细胞：HCG注射后20h为小鼠卵母细胞进行SrCl孤雌激活的最适卵龄;激活液中CCB的存在对小鼠孤雌胚胎的发育有利。 2．为了提高供体细胞中处于G／G期细胞的比例，本研究将传代培养4-6代的兔胎儿成纤维细胞分别进行下面不同处理：①20mM Roscovitine培养24h;②2μg／ml Aphidicolin培养24h;③完全汇合;④血清饥饿3天;⑤血清饥饿7天;⑥对照组。结果表明，完全汇合是供体细胞同步于G／G期较好的方法。 3．本实验用几种不同的融合条件融合兔-小鼠种间核移植重组胚，结果表明电场强度为180V／mm、脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次是构建兔—小鼠种间核移植重组胚的最佳电融合条件。 4．分别以处于完全汇合状态、70％～80％汇合的兔胎儿成纤维细胞为供体细胞，以小鼠卵母细胞为受体细胞进行核移植，构建的重组胚在体外培养，结果表明，完全汇合与处于70％～80％汇合的兔胎儿成纤维细胞作供体所构建的种间核移植胚胎，尽管卵裂率与囊胚发育率在统计上无显著差异(P0.05)，但完全汇合组的卵裂率与囊胚发育率都略高于对照组。 5．以兔胎儿成纤维细胞为供体细胞，以小鼠卵母细胞为受体细胞构建的重组胚在体外可发育到囊胚期，说明小鼠卵胞质能够使兔体细胞发生发育程序重编，完成早期胚胎的发育。 实验研究二：以小鼠胎儿成纤维细胞为供体，兔去核卵母细胞为受体进行小鼠-兔种间核移植研究，结果如下： 1．为了寻找体外培养兔胚胎的最佳培养条件，本实验将孤雌激活的兔胚胎分别放入Ham’s F+BSA、1640+BSA、M199+BSA、RD培养液(1640：DMEM=1：1)+BSA、RD+FBS五种培养液进行体外培养，研究发现RD+FBS内孤雌激活兔胚的囊胚发育率明显高于其他各组，表明RD+FBS为兔胚胎的最佳培养液。 2．本实验用几种不同的融合条件融合小鼠—兔种间核移植重组胚，结果表明电场强度为240V／mm，脉冲时间为20μs，脉冲次数为2次为构建小鼠—兔种间核移植胚胎的最佳电融合条件。 3．以小鼠胎儿成纤维细胞为供体细胞，以兔卵母细胞为受体细胞构建的重组胚在体外可发育到囊胚期，说明兔卵胞质可使小鼠体细胞核发生发育程序重编，并完成其早期胚胎发育。