柔嫩艾美耳球虫早熟株选育及生物学特性研究

作     者：韩静芳 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：俞纯方;黄兵

授予年度：2007年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：柔嫩艾美耳球虫 早熟株 选育 生物学特性 18S rRNA基因 

摘      要：鸡球虫病是一种重要的寄生虫性原虫病，对养禽业造成巨大的经济损失。据估计，全世界每年因球虫病造成的经济损失达20亿美元。该病的主要特征是减轻体重和降低饲料转化率。目前，球虫病的控制主要依靠药物，但由于耐药虫株的普遍存在以及人们对药残问题的日趋关注等原因，使抗球虫药的发展受到极大的限制。因此，人们把研究重点转向鸡球虫病的免疫预防。 1975年Jeffer建立了***早熟株选育方法：通过亲代虫株多次选择最早成熟的卵囊反复传代后，使其内生发育周期缩短，成为一株潜在期明显缩短、繁殖力和致病性显著降低，但保持良好免疫原性的***早熟株。经研究表明，早熟株的弱毒性和早熟性具有遗传稳定性，放松选择压力反复传代后也没有恢复现象。随后，各国科学家对艾美耳属7个种球虫都进行早熟选育：***(McDonald et al．，1982)，***(McDonald and Shirley，1984)，***(Shirley et al．，1984)，***(Shirley and Bellatti，1984)，***(McDonald et al．，1986 and Shirley and Bellati，1988)，***(Shirley et al．，1986)，***(McDonald et al．，1986)，并研究其生物学特性，在深入了解鸡球虫病的保护性免疫机制基础之上研制了抗鸡球虫病的早熟株弱毒活苗，在免疫预防球虫病中发挥了极其重要的作用。目前，已有2种球虫早熟株疫苗注册上市即英国的Paracox和捷克的Livacox，通过早熟选育方法获得的弱毒苗是球虫疫苗的研究方向。 本文以***孢子化卵囊为虫种，采用早熟株选育方法对***进行连续26代早熟选育，其潜在期由141 h缩短至118 h，缩短了23 h。对早熟株与母株孢子化卵囊大小、繁殖能力、致病性和免疫原性等基本生物学特性进行比较，结果表明：早熟株孢子化卵囊比母株的小且差异显著(P0.05)。用4个不同剂量球虫卵囊分别感染鸡时发现，早熟株繁殖能力与母株相当，每个卵囊的繁殖能力随着剂量的增大而减小;早熟株的排卵囊高峰较母株前移，但峰值较母株低。用临床症状、平均增重、死亡率、病变记分等指标对致病性进行研究，结果显示：4个剂量组早熟株平均增重与对照组相比差异不显著(P0.05)，而母株组与对照组相比平均增重显著下降(P0.05或P0.01)：4个剂量组的早熟株组死亡率均为0，而母株组分别为0、25％、25％、31.3％;感染剂量越大，早熟株与母株间病变记分差异越显著，由此认为，早熟株的致病性低于母株。在同等剂量免疫之下，平均增重、死亡率、盲肠病变记分及饲料转化率等方面的分析表明，早熟株的免疫原性与母株相当。另外，各免疫组对球虫卵囊的再攻击产生明显的抑制作用，各免疫组对同种同株球虫攻击时的卵囊抑制率高于同种不同株球虫卵囊的攻击;两次免疫后，早熟株和母株免疫组对攻虫后的卵囊排量都有强烈的抑制作用，卵囊抑制率均在95％以上。 本实验通过放松选择传代对所选育的***早熟株连续传三代来对其遗传稳定性进行研究，结果表明，***早熟株在潜在期及排卵囊规律方面都较稳定。 为了在基因水平上对***早熟株进行更深入研究，本文以***早熟株与母株的18S rRNA基因作为研究目标，根据Barta提供的真核生物18S rRNA PCR扩增通用引物从***早熟株和母株孢子化卵囊总DNA中扩增出18S rRNA基因，经琼脂糖凝胶电泳检测，将大小与18S rRNA基因预计分子量一致的片段纯化后连接到pGEM-T-easy克隆载体中，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到的转化子经PCR鉴定筛选阳性克隆后进行测序及序列分析，登录GeneBank。结果表明，***早熟株与母株的18S rRNA基因序列全长分别为1796bp和1799 bp，二者同源性为99％，早熟株18S rRNA基因共有17个碱基发生突变，二者的二级结构也发生很大的差异，早熟株与母株基因登录号分别为：EF210326和EF210325，***早熟株18S rRNA基因在GeneBank中尚属首次登录。