生物质合成气厌氧发酵制乙醇调控技术研究

作     者：张炎达 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋安东;王风芹

授予年度：2015年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：生物质合成气 厌氧乙醇发酵 发酵初始pH值 铵离子 钙离子 镁离子 酶 

摘      要：合成气厌氧发酵乙醇目前被认为是一项极具潜力与竞争力的工程应用技术,已成为当前研究利用生物质材料制取生物乙醇的一个方向,为研究不同基础因素对该发酵的影响和获得能显著提高乙醇发酵的优良实验组合,本文以实验室富集纯化获得的菌系A-fm4和国外关注较多的C.ljungdahlii和C.autoethanogenum DSM10061为对象进行对不同发酵基础条件调整下利用生物质合成气进行分批发酵的实验。通过研究发酵培养基初始pH对发酵过程的影响发现其对菌体生长和乙醇产量均有显著性作用,低初始pH(4.0.0)抑制菌体生长和乙醇发酵。分析比较发酵菌A-fm4、C.ljungdahlii和C.autoethanogenum DSM10061在梯度初始pH下的发酵结果而得到其优化值为7.0。在优化初始pH值7.0下上述三种发酵菌的最大菌体量分别为0.048、0.171、0.087 g/L DW,较低pH(4.0)其最大乙醇产量分别提高2.4倍、2.2倍和4.6倍,乙醇生成速率分别提高5.1倍、2.9倍和4.7倍。优化初始pH值7.0能够显著促进代谢关键酶氢化酶(Hase)、一氧化碳脱氢酶(CODH)、乙醇脱氢酶(ADH)、乙酸激酶(ACK)的活性水平,且发酵菌种类不同受其影响的程度存在差异。低浓度的NH可促进菌体生长和乙醇发酵,当其浓度高于9.35 mmol/L时,菌体生长和乙醇发酵随其浓度的增大而抑制显著,NH浓度18.7 mmol/L4.8 mmol/L会促进乙酸发酵。对菌株在菌体生长期和乙醇/乙醇发酵期内四种关键酶的活性研究表明,关键酶Hase、CODH、ADH和ACK均受高浓度(149.6 mmol/L)NH抑制,且菌体生长期的酶活水平均高于发酵期的值,Hase、CODH、ADH随NH浓度升高而酶活显著下降,而对ACK则在NH浓度18.7 mmol/L至37.4 mmol/L浓度下有所提高。这说明低浓度或未有NH下可促进还原力的产出来提高碳源的利用效率而利于乙醇发酵,而较高浓度NH抑制代谢途径,致使菌体生长和乙醇发酵受阻。实验还发现菌株C.ljungdahlii和C.autoethanogenum的K值分别为208.131 mmol/L和240.373 mmol/L,耐铵能力较强,可作为未来耐铵菌株的驯化提供材料,为降低工业生产成本和减少合成气净化工艺工序奠定基础。另外,生物质合成气发酵中发酵菌对氮源的需求主要来源于氨基氮,而对无机氮源的利用能力有限,发酵中可以以氨基氮的变化来反映氮源的变化,且在发酵中后期氨基氮的变化不明显。浓度1.80 mmol/L的Ca利于发酵菌的生长和乙醇发酵,也可促进乙酸发酵,但更利于乙醇的发酵。发酵菌在浓度1.80 mmol/L的Ca下各关键酶活性均表现出发酵期小于生长期(C.autoethanogenum DSM10061除外),Ca不同浓度可以显著影响到各关键酶的酶活水平来影响发酵过程,尤其是对ACK的促进作用;浓度6.25 mmol/L的Mg能够促进发酵菌的生长,缩短菌体的适应期时间。低Mg浓度利于乙酸发酵,高Mg浓度降低乙酸发酵能力。对于不同发酵菌,浓度6.25 mmol/L的Mg在促进乙醇和乙酸的程度不同,6.25 mmol/L的Mg浓度利于A-fm4的乙醇发酵,且利于C.autoethanogenum DSM10061的乙酸发酵,但可降低C.ljungdahlii的乙酸发酵。关键酶CODH和Hase在发酵不同阶段的酶活受到浓度6.25mmol/L的Mg的促进(除A-fm4的Hase外),在乙醇发酵期,浓度6.25 mmol/L的Mg显著提高ACK的酶活,而ADH浓度1.25 mmol/L下的活性更高;Ca与Mg的交互作用对发酵的影响明显,Ca与Mg对菌体A-fm4生长无交互作用,对乙醇和乙酸发酵的交互作用显著,且Ca与Mg对乙酸发酵存在拮抗现象,Minitab软件优化出Ca与Mg对菌体A-fm4的交互值分别为1.80 mmol/L和6.25 mmol/L。交互结果促进菌体生长、乙醇和乙酸发酵,显著提高供试菌的单位菌体乙醇和乙酸发酵能力,对菌系A-fm4的两条代谢途径可协同促进,对菌体C.ljungdahlii和C.autoethanogenum DSM10061的乙醇和乙酸代谢支路也具有促进。最后,各因素优化值对生物质合成气厌氧乙醇发酵的联合影响显著,各因素优化值(NH0 mol/L,Mg6.25 mmol/L,Ca1.80 mmol/L)在培养基初始pH值7.0的发酵条件下的乙醇发酵效果最好,且能显著减弱单位菌体发酵乙酸的能力,为当前提高乙醇发酵的优良实验组合。