二化螟和稻纵卷叶螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的鉴定与表达模式分析

作     者：张邦贤 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林华峰

授予年度：2017年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：二化螟 稻纵卷叶螟 谷胱甘肽-S-转移酶基因 序列分析 表达模式 

摘      要：二化螟Chilo suppressalis和稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis是亚洲地区最重要的两种水稻害虫,对我国及东南亚地区的水稻生产造成严重的经济损失。长期以来,对二化螟和稻纵卷叶螟的防治主要依靠化学农药,但无选择性地使用杀虫剂,给二化螟和稻纵卷叶螟造成了一定的选择压力,使这两种害虫对杀虫剂的敏感性降低,导致防治更为困难。目前对于二化螟和稻纵卷叶螟对杀虫剂敏感性降低的研究主要集中于杀虫剂靶标位点的突变和解毒酶活性的改变。谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)作为一类重要的解毒酶,在昆虫对内源和外源有毒物质的代谢过程中起非常重要的作用。GST催化有害物质与还原型谷胱甘肽(GSH)结合,增加其水溶性,从而能被更容易地排出体外,降低杀虫剂对昆虫的毒性。目前,关于二化螟和稻纵卷叶螟GST的报道比较有限。因此,本论文针对二化螟和稻纵卷叶螟GST的编码基因开展研究,从这两种害虫的转录组数据库里鉴定GST编码基因,明确GST在各组织中的表达模式,并研究了在亚致死剂量杀虫剂胁迫下GST基因表达水平的变化。本研究结果可为探索二化螟和稻纵卷叶螟对杀虫剂敏感性降低的分子机制奠定前期基础。1.二化螟和稻纵卷叶螟GST基因的鉴定和生物信息学分析通过搜索二化螟和稻纵卷叶螟转录组,分别鉴定出16个和25个GSTs基因。通过序列比对和生物信息学分析,明确鉴定出的二化螟16个GSTs分别属于6个已知的GSTs家族(Delta,Epsilon,Omega,Sigma,Zeta,Theta)和unclassified家族;稻纵卷叶螟的25个GSTs基因分别属于5个已知的GSTs家族(Delta,Epsilon,Omega,Sigma,Zeta)和unclassified家族,未鉴定出Theta家族GSTs基因。GSTs多氨基酸序列连配结果显示,二化螟CsGST蛋白与稻纵卷叶螟CmGST蛋白均具有谷胱甘肽结合位点和底物结合位点。谷胱甘肽结合位点的氨基酸残基在二化螟和稻纵卷叶螟Delta和Epsilon家族高度保守,它们可能是催化作用的关键残基。二化螟和稻纵卷叶螟谷胱甘肽-S转移酶在N端GSH结合位点和C端底物结合位点的高度的一致性,暗示了在进化过程中昆虫GSTs功能的保守性。通过构建系统进化树,明确了二化螟和稻纵卷叶螟GSTs和其他模式昆虫GSTs的系统进化关系。2.二化螟GST基因的组织表达谱和应对杀虫剂胁迫的表达模式以二化螟β-actin基因作为内参基因,对二化螟16个GSTs基因在幼虫不同组织(中肠、马氏管、脂肪体)中的mRNA相对表达水平进行了定量分析,结果显示:CsGSTd2、CsGSTd3、CsGSTe1、CsGSTo1、CsGSTo3和CsGSTt1主要在脂肪体中表达;CsGSTe3在马氏管中大量表达;其他基因在各组织中的相对表达水平没有显著差异。利用双酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺对二化螟进行亚致死剂量和时间诱导后,使用RT-qPCR技术检测二化螟GSTs基因应对杀虫剂胁迫的表达模式。结果表明:经氯虫苯甲酰胺诱导24h后,二化螟Delta家族和Epsilon家族GSTs基因相对表达水平均显著高于CK和6h处理,二化螟CsGSTe1表达量显著上调。Omega家族的GSTs在处理12h后,表达量相比CK也出现了显著上调。CsGSTs2在6h和12h与CK没有显著差异,无明显的时间效应。CsGSTt1与Delta家族表现了相似的表达模式,在6h处理后,CsGSTt1表达水平显著下调,但是在12h处理后,表达水平与CK相比,有显著上升。CsGSTz1在6h,12h处理后与CK相比,表达量有上调,但没有显著差异。Unclassified家族GSTs在6h和12h处理后,表达量均有下调,CsGSTu1下降水平显著,CsGSTu2相对表达水平下降但未达到显著差异。3.稻纵卷叶螟GSTs基因的组织表达谱和应对杀虫剂胁迫的表达模式以稻纵卷叶螟β-actin基因作为内参基因,对稻纵卷叶螟25个GSTs基因在幼虫不同组织(中肠、马氏管、脂肪体)中的mRNA相对表达水平进行了定量分析,结果显示:CmGSTe1,CmGSTe2,CmGSTe5在脂肪体中的表达量显著高于在中肠和马氏管中的表达量。利用有机磷类杀虫剂毒死蜱对稻纵卷叶螟进行亚致死剂量和时间诱导后,使用RT-qPCR技术检测稻纵卷叶螟GSTs基因应对杀虫剂胁迫的表达模式,结果表明:经毒死蜱诱导24h后,1个Delta家族(CmGSTd2),2个Epsilon家族GSTs(CmGSTe6和CmGSTe7)相对表达水平显著上调,其中CmGSTe6诱导24h后相对表达量最高。CmGSTd1、CmGSTd3、CmGSTd4的表达量波动范围很小,未达到显著水平。CmGSTe1,CmGSTe4,CmGSTe5,的表达模式比较一致,均是在处理24h后相对表达量显著低于CK。CmGSTe8和CmGSTe9的相对表达量较CK有所上升,但无显著性差异。CmGSTo1与CmGSTo2的时间效应比较一致,相对表达量出现了下调,CmGSTo3的表达量有所上调,但均未达到显著水平。Sigma家族的CmGSTs1,CmGSTs2,CmGSTs4,CmGSTs5表现出了相似的表达模式,相对表达水平有所上升,与CK的表达量无显著差异。CmGSTz1和CmGSTu1的时间效应相似,均是在诱导24h后,表达量显著降低。CmGSTz2和CmGSTu2的表达量较CK没有显著变化。CmGSTd2、CmGSTe6、CmGSTe7的表达量上升显著,而且这三个基因属于昆虫特有的Delta和Epsilon家族,暗示这些基因可能在外源化合物解毒代谢过程中起着重要作用。