合浦珠母贝微卫星标记的分离筛选及F2代家系的遗传多样性分析

作     者：油九菊 

作者单位：上海海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：喻达辉

授予年度：2012年

学科分类：090801[农学-水产养殖] 0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：珍珠贝 分子标记 分离规律 遗传结构 哈迪-温伯格平衡 遗传图谱 等位基因 杂合度 多态信息含量 遗传相似度 

摘      要：合浦珠母贝(Pinctada fucata)是我国海水珍珠养殖的重要育珠贝，在我国海水珍珠产业中占有重要的位置。本研究利用FIASCO法进行了新的微卫星序列筛选，同时对实验室以前设计的微卫星引物、根据GenBank数据库的EST序列设计的引物以及文献发表的引物进行了筛选，然后利用筛选的有效引物对大亚湾随机群体和F2家系进行了遗传变异分析，主要结构如下： 1.微卫星引物筛选。(1)采用生物素标记的(AC)探针和磁珠富集法构建合浦珠母贝基因组DNA微卫星富集文库。随机挑选2097个克隆进行筛选，得到483个候选克隆(23.03%)，对其中135个阳性克隆测序分析发现122个克隆含有微卫星重复单元(90.37%)。进一步通过序列比对，获得65个具有特异微卫星序列的阳性克隆(53.28%)，其中包含85个微卫星DNA结构域，其完美型(perfect)、非完美型(imperfect)和混合型(compound)分别占82.36%、8.24%和9.41%，重复次数主要分布于50之间(95.74%)，平均重复次数为7.83，(AC/GT)n重复所占比例最高(75.53%)。利用Primer Premier5.0设计了65对微卫星引物，通过三亚养殖群体筛选，共获得20个新的可稳定扩增的位点，其中14个具多态性;20个新位点经F2代家系筛选，19对稳定扩增;(2)对本实验室以前发表的多态引物进行F2代家系筛选，共获得4个可稳定扩增的位点;(3)对本实验室设计的微卫星引物进行F2代家系筛选，共获得35个可以稳定扩增的位点;(4)对文献中已发表引物进行F2代家系筛选，共获得36个可以稳定扩增的位点;(5)对GeneBank中合浦珠母贝EST序列设计18对微卫星引物，并进行F2代家系筛选，共获得11对新的可稳定扩增的位点。共获得105个有效扩增位点。这些位点可用于合浦珠母贝群体及家系的遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究。 2.大亚湾群体的遗传多样性分析。利用上述20个位点中的5个对大亚湾随机种群进行了遗传多样性分析，共检测到29个等位基因，片段长度范围为12202bp。各位点等位基因数2个，平均等位基因数(A)5.8个;有效等位基因数(Ae)为1.5957.6962，平均为2.9554;观测杂合度(Ho)为0.3000.7000，平均0.4400;期望杂合度(He)为0.3797.8384，平均0.5737;多态性信息含量(PIC)为0.3573.8048，平均0.5204(0.5)。实验结果表明，大亚湾群体的遗传多样性非常丰富。 3. F代家系遗传多样性分析。多样性分析结果显示，F代家系Shannon指数及Nei’s基因多样性指数平均值分别为0.6433和0.4226，表明F代家系具有较高的遗传多样性。共105个微卫星位点用于F代家系及其亲本基因型的检测，分析结果显示，有72个位点在至少一个亲本及子代中发生分离，多态位点比例高达68.57%。亲本多态位点数占总有效扩增位点数的比例(68.57%)稍高于子代(67.62%)，表明F代家系的遗传多样性有所降低。遗传相似度分析显示，F代家系与亲本间的平均遗传相似度为0.9722，家系个体间相似性指数位于0.6280.8836之间，平均0.7663。F代家系与亲本间的遗传分化指数为F=0.0110。聚类分析结果显示，F代中72个个体和父母本聚为一大支，其余22个个体另聚为一大支，两代中有14个个体(14.58%)两两聚为7支，其余82个体分别单独聚群。研究结果表明，两代家系间遗传分化处于低度水平，没有明显的遗传分化。 4.标记在亲本及F代家系中的遗传分离。根据Hardy-Weinberg平衡的卡方检验(PHW)，72个位点中有23个(31.94%)处于平衡状态(PHW0.05)，其他49个位点(68.06%)都不同程度地偏离了平衡。2检验表明，23个标记显著偏离孟德尔遗传分离比例(P 0.05，31.94%)，其中15个偏分离位点表现为杂合子过剩、纯合子缺失，另外7个偏分离位点表现为纯合子过剩，而杂合子不足，1个处于Hardy-Weinberg平衡状态;共有25个微卫星标记在父本中发生分离，其中偏分离标记数(4个)占父本总分离标记数的16%，有11个微卫星标记在母本中发生分离，偏分离标记数(3个)占母本总分离标记数的27.27%，可见雄性偏分离标记的比例明显低于雌性，在性别间呈现了显著差异。49个位点符合孟德尔遗传分离比例，共得到父本特有标记21个，可用于雄性遗传图谱的构建;母本特有标记8个，可用于雌性遗传图谱的构建;父母本共享标记20个，可用于亲本共同的遗传图谱的构建。