云南药用野生稻白叶枯病抗性相关蛋白筛选
作者单位：云南大学
学位级别：硕士
导师姓名：戴陆园
授予年度：2013年
学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学]
摘 要：水稻是人类最主要的粮食作物之一。白叶枯病是水稻最重要的细菌性病害,每年对稻谷生产造成巨大损失。从具有广谱抗性的优异种质资源中挖掘抗白叶枯病基因并加以利用是最经济有效的措施之一。研究表明云南药用野生稻对白叶枯病具有很好的抗性。从抗性相关蛋白筛选鉴定可以为新抗性基因发掘提供十分有用的信息。 本实验以具有抗性的云南药用野生稻为供试材料,并采用对供试材料具有不同反应的云南高原粳稻区白叶枯病菌株2001-28和18F,进行接种鉴定,同时设置用清水接种的对照;采用双向电泳-质谱技术分析两种反应类型中药用野生稻蛋白随时间(2h、24h、48h、72h、96h)变化情况,按设定在表达浓度上发生2倍以上变化蛋白界定为差异表达蛋白;观察相同时间点两种反应类型分别与对照比较的差异蛋白及两种反应类型之间的差异蛋白;从中挑选出表达较稳定、并与抗病性相关联的部分蛋白作为候选抗病相关蛋白进行质谱分析鉴定;根据Gene ontology数据库,分析候选抗病相关蛋白。研究结果如下： 1.两种反应类型中的差异蛋白数目随时间的变化规律 与对照相比较,亲和反应中每个时间点(2h、24h、48h、72h、96h)得到的差异蛋白数目分别为：30、36、34、25、13个;相应地,非亲和反应中每个时间点得到的差异蛋白数目分别为：30、71、51、44、20个。差异蛋白数目随时间变化趋势均为先上升,然后逐渐下降;两种反应差异蛋白数目达最多的时刻均在24h;在同一时间点上表达差异蛋白数目均为非亲和反应远多于亲和反应。非亲和反应与亲和反应比较,每个时间点的差异蛋白数目分别为：29、65、44、38、19个,提示两种反应差异最大的时刻为24h左右。 2.差异蛋白质谱鉴定及功能分类 抗病相关蛋白存在于非亲和反应和亲和反应中,为了更加全面而准确的筛选到在寄主抗病防御过程中起关键作用的蛋白,本次筛选出的25个蛋白点包括以下三个方面：(1)满足对照、亲和反应及非亲和反应三者之间均具有表达差异的差异蛋白点14个。(2)非亲和反应中特异表达的差异蛋白点6个(在亲和反应中不发生表达)。(3)亲和反应中特异表达的差异蛋白点5个(在非亲和反应中不发生表达)。将25个差异蛋白成功进行质谱鉴定并按其功能分为五类：与光合作用相关的蛋白共10个(40%);与抗逆胁迫相关的蛋白共11个(44%);与氮代谢相关的蛋白2个(8%);与糖酵解及核酸形成相关蛋白分别为1个(4%)。与对照相比,在11个与抗逆胁迫相关蛋白中,热休克蛋白、黄酮3‘-0-甲基转移酶1(Flavone3’-O-methyltransferase1)、R2R3-MYB转录因子这3个蛋白在非亲和反应中表现为特异上调,而在亲和反应中不表达;在亲和反应中特异下调的腈水解酶在非亲和反应中不表达;同时,在亲和反应中表达下调的类萌发素蛋白(germin-like protein)、肽基脯氨酰基顺反异构酶(peptidyl-prolyl-cis-transisomerase)、铁蛋白、、分子伴侣4个蛋白在非亲和反应中上调表达。从这一结果可以推测在非亲和反应中上调表达的抗逆胁迫相关蛋白可能通过三条途径使宿主获得抗性：①R2R3-MYB转录因子、黄酮3’-0-甲基转移酶1、腈水解酶和肽基脯氨酰基顺反异构酶调控产生次生代谢产物作为植物进行自身防御的关键物质。②以上有些次生代谢产物(如JA和SA)作为信号转导分子调控PR蛋白的表达来抵御病原菌的侵害。③过氧化物还原酶、铁蛋白、热休克蛋白、分子伴侣可能协同作用来抵抗病菌侵染时细胞内积累的ROS。肽基脯氨酰基顺反异构酶、黄酮3’-0-甲基转移酶1、R2R3-MYB转录因子和类萌发素蛋白可能只存在于药用野生稻与白叶枯病菌互作中并与药用野生稻的广谱性抗性紧密相关,值得进一步研究。
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