基于人工TALE技术的抗双生病毒研究

作     者：陈方圆 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周雪平

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：TYLCV CaLCuV TALE 双生病毒 

摘      要：双生病毒是一类具有单链环状DNA的植物病毒,已在多个国家和地区造成严重危害。但现有防治双生病毒的策略都存在一定的缺陷,成效不显著,因此,需要不断研发抗双生病毒新技术。类转录激活因子(Transcription-like effector, TALE)是植物致病菌黄单孢杆菌通过III型分泌系统注入到寄主细胞内的一类具有DNA结合活性的蛋白质,根据其识别DNA序列的特征,近年来已迅速发展成有效的基因组编辑工具。因此,本文利用人工TALE蛋白进行抗双生病毒研究。 以在我国发生危害最重、分布最广的单组分双生病毒——番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)为对象,通过与双组份双生病毒甘蓝曲叶病毒(Cabbage leaf curl virus, CaLCuV)作比较,利用TALE在线工具https://***/分析TYLCV和CaLCuV的潜在靶点,根据天然TALE识别序列的特征、TALE靶点的选择原则和双生病毒复制所需的重要元件,确定了TYLCV和CaLCuV的复制蛋白(Rep)结合位点作为人工抗双生病毒TALE的靶点。利用Golden-Gate克隆法快速组装分别针对TYLCV和CaLCuV的TALE质粒,并通过酶切、测序和BLAST比对,成功构建了分别针对TYLCV和CaLCuV的TALE质粒pTAL1-L4和pTAL1-L5。 为了在体外验证人工TALE的活性,建立并优化了TALE的原核表达与纯化条件。根据前期研究,设计并获得了N端缺失152个氨基酸、C端保留46个氨基酸的截短的TYLCV-TALE-L4、CaLCuV-TALE-L5。进一步将截短后的TYLCV-TALE-L4构建到5种含有不同融合标签的表达载体上,在相同的条件下通过比较目的蛋白的表达量,确定’TALE在pET-28a、pET-32a及pMBP三个表达载体上的表达效果较好。又将构建在pET-32a的TALE转化入4种不同的表达菌株中,发现表达载体在BL21(DE3)、BL21(DE3)-pLus及BL21(DE3)-Tf2表达菌株内的表达效果较好。考虑到标签对融合蛋白大小的影响和实验操作步骤的简便性,选择了pET-28a表达载体以及BL21(DE3)表达菌株进行L4和L5蛋白的大量诱导和纯化,最终建立了分别针对TYLCV和CaLCuV的TALEs的高效原核表达体系。 为了研究人工TALEs的抗病毒活性,以TALE蛋白的靶向DNA序列为探针,将原核表达系统获得的人工PALE蛋白与标记过的探针进行凝胶阻滞实验,发现人工TALE蛋白L4可以特异性结合TYLCV相关序列,人工TALE蛋白L5可以特异性结合CaLCuV相关序列。进一步将具有核定位信号的TALE构建到带有flag标签的pCAMBIA2300载体上,通过农杆菌浸润和Western杂交印记分析发现人工TALE蛋白能够在植物中表达。将该表达载体与靶标双生病毒共浸润后,在不同时间段提取植物可溶性蛋白和基因组DNA,利用Southern杂交印记分析,发现瞬时表达的人工TALE蛋白L4会影响TYLCV病毒DNA的积累,人工TALE蛋白L5会影响CaLCuV病毒DNA的积累。为获得稳定表达人工TALE的转基因植株,分别利用叶盘法和花浸泡法将人工TALE转化本氏烟和拟南芥植株,通过Western杂交印记分析筛选成功获得3株过表达L5的TO代转基因本氏烟和7株过表达L5的TO代转基因拟南芥,为进一步验证人工TALE的抗病毒活性奠定了重要基础。