大蒜、绊根草中重金属抗性分子机制的研究

作     者：冯保民 

作者单位：中国科学院植物研究所 

学位级别：硕士

导师姓名：麻密

授予年度：2001年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：大蒜, 绊根草, 金属硫蛋白基因, 植物络合素合酶基因, 酵母突变体功能互 补, 酵母表达文库 

摘      要：日益加剧的重金属污染已经危害到了全球的生态环境以及人类健康。在分子 水平上阐明植物中的重金属抗性机制并应用于环境修复和绿色农业是植物科学 和环境科学以及农业科学的交叉点和新的生长点。为了了解植物重金属抗性的分 子机制，我们的研究主要是从重金属抗性植物材料大蒜(Allium sativum L.)和绊根 草(Cynodon dactylon)中分离重金属抗性相关基因，并研究它们在重金属抗性机制 中的功能。 在高等植物中有迹象表明，一种富含半胱氨酸的低分子量蛋白-类金属硫蛋白 (Metallothioneins Like，MTs Like)和一类具有γ-(Glu-Cys)n-Gly特殊结构的 多肽-植物络合素(Phytochelatins，PCs)在重金属抗性机制中占有重要地位。然而人 们对于同一种植物中这两种重金属结合肽作用的相互关系还缺乏了解，同时对于 MT Like基因以及PCs合酶基因在同一种植物中的表达模式如金属离子专一性、 时空表达特点等，还没有文献报道，因此本文将首先以这两个基因为切入点进行 研究。 本研究采用RACE的方法，从大蒜中分离得到了类金属硫蛋白(MT-Like) 的cDNA序列(GenBank Accession No-AY050510)。PCR和Southern Blot分析表 明，大蒜基因组中不仅存在类金属硫蛋白基因，而且可能以基因家族的形式存在。 对获得的MT Like cDNA进行的序列分析及同源性分析表明，大蒜MT Like cDNA含有一个完整的开放阅读框架，编码73个氨基酸，其中12个为半胱氨酸， 占氨基酸总数的16.4％，并与其他植物如水稻、小麦、紫羊茅草中的类金属硫蛋 白基因同源性较高，其中最高达89％。对该基因编码的氨基酸序列和结构分析表 明在N-端、C-端结构域中分别含有3个典型的金属硫蛋白的结构模式 Cys-Xaa-Cys，属于典型的Type-1类金属硫蛋白。这些Cys-Xaa-Cys特征结构表 明大蒜MT Like基因编码的蛋白可以结合二价金属离子。重金属胁迫下大蒜根中 MT Like基因在转录水平的表达检测表明，MT Like基因的表达受重金属离子 Cu、Cd的诱导，暗示MT Like基因在大蒜对重金属的抗性中有重要作用。此 外，用能谱电镜技术研究大蒜中重金属的积累与分布，以及用组织原位杂交技术 分析MT Like基因的表达定位与重金属的积累、转运的关系已在进行之中。 植物络合素也是富含巯基的多肽化合物，在重金属抗性中起重要作用。由植 中田科学阶梢物所恤 卜论 义 物络合素结构中存在的Y－酚胺键或 p－Ala可知 PCs不是基因表达的直接产物， 而是以GSH为前体的酶促反应产物。目前已知 Y．谷氨酚半眯氨酸二肽转肽酶(简 称为 PCs合酶，phytochelatin synthase，PCS)是 PCs合成途径的关键酶，编码这 一关键酶的基因目前己在小麦、拟南芥菜和裂殖酵母中克隆。由于这一基因在不 同物种中的保守性较低，其克隆较困难。本研究通过设计植物络合素合酶基因简 并引物，从大蒜中扩增得到了345hp的CDNA序列。序列分析和推测的氨基酸序 列同源性比较表明，此序列的翻译产物与己知的植物络合素合酶同源性最高，此 cDNA序列应为大蒜植物络合素合酶基因的部分cDNA序列(GenBank AcceSSion NO．AF384llo卜目前大蒜植物络合素合酶基因的全长序列的扩增，以及这两种与 重金属抗性有关的基因(MT Like，PCS)的表达模式仍在研究中。 木文还尝试了利用酵母重金属敏感突变株M379／8功能互补的方法从重金属 抗性植物绊根草中分离新的重金属抗性相关基因。构建了用于转化的酵母质粒表 达文库，探索了酵母转化体系建立的条件。曾尝试多种转化方法，并对其中的条 件进行了优化改进。下～步的工作将集中在合适的酵母突变体的筛选或穿梭表达 载体的选择标记基回替换上。