蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能的初步分析

作     者：敬帆 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李名扬

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：蜡梅 CpAGL6基因 启动子 GUS基因 

摘      要：MADS-box基因是一类广泛存在于植物界的基因家族,是植物生长发育过程中非常重要的调控因子,如参与调节营养生长、种皮发育、子房发育、胚形态建成、根的形成和共生诱导等。目前对MADS-box基因调控机理的研究已成为植物分子生物学领域中的一大热点。AGL6亚家族基因属于MADS-bo x基因MIKC家族,为AP1/AGL9组的一个遗传冗余基因。研究表明AGL6基因是与花器官发育相关的基因。重庆市花卉工程技术研究中心在前期工作中已从蜡梅(Chimonanthus praecox (L.)Link)中克隆了CpAGL6基因(GenBank登录号为FJ807387),长度为948 bp。提取蜡梅不同组织和不同时期花芽RNA进行RT-PCR分析,发现该基因在蜡梅花器官中特异表达,并且参与花原基的形成等。启动子是转录水平上的一个重要调控元件,通过与多种转录因子相结合,进而决定了基因的时空表达模式及表达强度。目前,AGL6基因已被大量分离并研究,但是还未见到AGL6基因启动子研究的相关报道。为了弄清CpAGL6基因启动子在植物体内的表达特性,我们从蜡梅中克隆得到了该基因的上游调控序列,并对启动子的功能进行了初步分析,本文主要研究内容和结果如下：1.在CpAGL6基因ORF的5’端设计三条巢式引物,利用hiTAIL-PCR法从蜡梅基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中包含启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。2.为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。在烟草叶片中的瞬时表达结果表明该启动子序列具备驱动报告基因GUS表达的功能。3.将经卡那霉素(Kanamycin)筛选后的抗性苗,进行GUS组织化学染色分析和PCR分子验证,获得转基因烟草株系。4.对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶,茎和花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,根中几乎不表达。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达。5.转基因植株经黑暗、赤霉素(GA3)和低温处理后,GUS酶活力均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子可能在抵抗非生物胁迫中起到非常重要的作用。6.对T2代转基因烟草幼苗进行GUS时间表达模式检测,结果表明,只有7d时烟草幼苗着色很浅,其余各时期都能明显地看到蓝色斑点,并且斑点的着色深度随生长进程逐渐加深。表明该启动子在前期生长进程中,随着烟草的生长,调控作用逐渐增强。