绿盲蝽温度受体基因的鉴定及功能研究

作     者：付婷 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：王桂荣

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：绿盲蝽 温度受体 气味受体 TRPA1 Painless Xenopus oocytes 

摘      要：昆虫的生长发育、迁飞、滞育、休眠等生命活动和重要的行为与温度变化息息相关。在长期的进化过程中,快速感知外界环境温度变化并迅速做出相应的行为反应对于昆虫的正常生存和繁衍极其重要。以前的研究表明瞬时受体电位通道(transient receptor potential,TRP)参与了昆虫对温度的感知行为,被认为是哺乳动物和昆虫体内温度的受体。绿盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dür)属于半翅目(Hemiptera),盲蝽科(Miridae),草盲蝽属(lygus Hahn),是我国多种农作物和果树上的重要害虫。本论文通过生物信息学方法分析绿盲蝽转录组数据,获得了绿盲蝽两个温度受体基因(TRPA1和Painless)的片段,通过PCR结合RACE技术克隆了编码TRPA1和Painless的全长c DNA序列;分析了TRPA1及Painless基因在绿盲蝽不同发育阶段及成虫不同组织中的相对表达量;通过真核表达结合双电极电压钳记录揭示了绿盲蝽TRPA1及Painless基因的功能,通过行为学实验研究了绿盲蝽对温度及化合物刺激的行为反应。主要研究结果如下:1.完成了绿盲蝽TRPA1基因的鉴定及功能研究。在触角转录组测序基础上,利用生物信息学方法获得了绿盲蝽TRPA1基因的4个序列片段,通过序列比对,结合分子克隆技术得到绿盲蝽TRPA1基因的四个剪切型的全长序列,分别命名为Aluc TRPA1-A、Aluc TRPA1-B、Aluc TRPA1-C、Aluc TRPA1-D。四个剪切型均包含6个保守的跨膜结构域及16个锚蛋白重复序列,该基因在1至5龄若虫及成虫中均有表达,且1龄若虫的相对表达量最高;在成虫的不同组织中,触角中的表达量最高。四种剪切型仅在腹部及翅的相对表达量存在显著差异。体外功能研究表明,除了Aluc TRPA1-D,其他三种剪切型均可被20-40?C逐渐上升的温度激活,而且重复刺激不会引起通道的钝化。Aluc TRPA1-A及Aluc TRPA1-B的激活温度小于25?C,而Aluc TRPA1-C的激活温度在25-30?C之间。除了对温度的反应外,四种剪切型中,仅Aluc TRPA1-A和Aluc TRPA1-C对刺激性化合物异硫氰酸烯丙酯(AITC)、肉桂醛(CA)及香茅醛(citronellal)有明显反应。2.完成了绿盲蝽Painless基因的鉴定及功能研究。利用生物信息学方法得到绿盲蝽Painless基因的4个c DNA片段,通过RT-PCR结合RACE技术克隆得到绿盲蝽Painless基因的全长序列,命名为Aluc Painless。该基因全长2736 bp,编码911个氨基酸,蛋白结构包含6个保守的跨膜结构域及8个锚蛋白重复序列。时空表达谱分析结果表明,Aluc Painless基因在整个生命周期均有表达,1龄若虫的相对表达量最高;在成虫的不同组织中,足中的表达量最高,头中最低。基于爪蟾卵母细胞的体外功能研究表明,10-3 mol/L的刺激性化合物不能激活Aluc Painless通道。20-45?C逐渐上升的温度可以激活Aluc Painless通道。由于Aluc Painless通道在20-25?C、20-30?C、20-35?C及20-40?C温度区间的反应值与对照组没有显著差异,因此Aluc Painless基因的激活温度大于40?C。3.完成了绿盲蝽对温度、气味刺激的行为反应实验。绿盲蝽在温度梯度平板上的分布主要集中于25-28?C,绿盲蝽在高温区没有分布,表明绿盲蝽能够感知环境温度。双向选择实验表明1%CA、10%CA、1%citronellal及10%citronellal趋避绿盲蝽,而绿盲蝽在AITC、CA及citronellal三种气味化合物不同浓度下的轨迹追踪实验表明,绿盲蝽能够通过嗅觉感知AITC、CA及citronellal并产生不适反应。