下丘脑弓状核蛋白激酶C参与神经元兴奋性调节的机制研究

作     者：王安琪 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒋星红

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071006[理学-神经生物学] 

主      题：下丘脑弓状核 蛋白激酶C 兴奋性 离子通道 转位 

摘      要：目的:本实验通过检测正常大鼠不同年龄阶段下丘脑弓状核(hypothalamic arcuate nucleus,ARC)中蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)的表达,旨在研究ARC中PKC是否参与神经元兴奋性的调节,并重点探讨其机制。方法:Western blot和免疫荧光技术检测PKC三种亚型在正常大鼠新生、青年、成年年龄阶段ARC中的表达,以及在原代培养的新生1天ARC神经细胞中的分布与表达;全细胞膜片钳电流钳技术和电压钳技术检测PKC在ARC神经元兴奋性调节中的作用;免疫细胞化学和Western blot技术检测ARC神经元在PKC激动剂Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)的作用下,PKC是否发生由胞质到胞膜的转位现象;运用免疫细胞化学和Western blot技术检测PKC转位抑制剂氯化白屈菜赤碱(Chelerythrine chloride,CC)孵育后是否能够改变由PMA诱导的ARC神经元中的PKC转位现象,并用全细胞膜片钳技术检测ARC神经元兴奋性及钠钾电流的变化。结果:1、Western blot结果显示,在新生、青年、成年年龄阶段大鼠ARC中均有PKCα、PKCβⅡ、PKCγ表达,但PKCγ在新生1天ARC中的表达非常少,与在青年、成年ARC中的表达相比,有显著性差异(p0.001);免疫细胞化学结果表明,在原代培养的新生1天大鼠ARC神经元及其周围胶质细胞中,PKCα、PKCβⅡ和PKCγ均有表达,但PKCγ表达极少。2、全细胞膜片钳电流钳结果显示,在0.1μM、1μM、10μM PKC激动剂PMA作用下,ARC神经元放电频率增高,兴奋性呈剂量依赖性增加,尤其在给予10μM PMA后,放电频率显著增加(p0.05)。3、全细胞膜片钳电压钳记录结果显示,在10μM PMA作用下,ARC神经元钠电流密度显著升高(p0.05),A型钾电流密度显著降低(p0.001)。4、免疫荧光及Western blot结果显示,在PMA作用下,PKCα和PKCβⅡ发生由胞质向胞膜的转位,其转位的细胞比率与对照组相比,均显著升高(p0.001)。ARC神经元经1μM和10μM CC孵育后,PMA诱导的PKC转位现象被阻断,PKCα、PKCβⅡ发生转位的细胞比率均显著下降(p0.001,p0.05);5、全细胞膜片钳结果显示,经1μM CC孵育ARC神经元30min后,PMA引起的细胞兴奋性增强可被部分阻断;经10μM CC处理ARC神经元后,几乎完全阻断了PMA引起的细胞兴奋性增强作用,与对照组相比,差异显著(p0.01)。同样ARC神经元经10μM CC孵育30min后,其由PMA引起的钠电流密度的升高、A型钾电流密度的降低均可被翻转(p0.01)。结论:(1)PKC三种亚型PKCα、PKCβⅡ、PKCγ在正常大鼠不同年龄的ARC内均有表达,但PKCγ不同于PKCα、PKCβⅡ,是随着大鼠的发育成长表达增高的。(2)ARC内PKC参与了神经元的兴奋性调节,表现为PKC激动剂PMA可引起神经元放电频率增高、钠电流密度增加、A型钾电流密度减小。(3)ARC内PKC参与神经元兴奋性调节是通过增加神经细胞中PKCα、PKCβⅡ转位继而影响钠、钾电流实现的。