一种新型重组疫苗pNb的抗黑色素瘤效果研究

作     者：叶阳 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马远方;张海龙

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肿瘤疫苗 黑色素瘤 NY-ESO-1 bFGF p4 

摘      要：背景恶性肿瘤在我国居民死因中占第二位,仅次于心脏病。恶性肿瘤显著降低病人生存期并给病人带来巨大经济负担,人们对其格外重视。对于恶性肿瘤有许多治疗策略,其中疫苗治疗是现今研究热点。疫苗治疗相比传统治疗(手术治疗、放疗、化疗)最为重要的优势是其激发的免疫应答在体内长期发挥作用从而最大限度的避免肿瘤复发。NY-ESO-1作为众多肿瘤疫苗靶点中的一位,因其在多种肿瘤组织中特异性表达、表达水平较高而成为有前景的肿瘤疫苗靶点。NY-ESO-1联合各种佐剂制备肿瘤疫苗在动物实验中表现出优秀的抗肿瘤效果。此外,NY-ESO-1靶点疫苗在***网站可见众多临床研究。已完成的有NY-ESO-1疫苗联合伊匹单抗用于治疗黑色素瘤的Ⅰ期临床试验,使用瑞喹莫德佐剂的NY-ESO-1疫苗用于治疗肿瘤的Ⅰ期临床试验。这些临床试验结果显示NY-ESO-1疫苗对于肿瘤病人有一定的有效率。此外,抗肿瘤的另一策略是抑制肿瘤血管新生,这是因为人们在较早的研究中已经认识到血管新生对于肿瘤的重要性。在没有血管新生的情况下肿瘤甚至长不到直径2mm大小。成纤维细胞生长因子(bFGF)作为第一个被鉴定的血管新生生长因子,在肿瘤血管新生和肿瘤生长中发挥重要作用。虽然bFGF疫苗的动物实验显示疫苗显著抑制肿瘤血管新生并抑制肿瘤生长,但是针对bFGF靶点的抗肿瘤药物未见有临床试验。p4是一种T细胞表位肽,能够激活T细胞而提高各种疫苗的免疫原性。p4常作为各种疫苗的分子内佐剂,动物实验的结果显示相比无p4佐剂的疫苗含有p4佐剂的疫苗具有更好的抗肿瘤效果。人们现今认识到T细胞免疫应答对于整个抗肿瘤免疫极其重要,p4因而也成为热门的疫苗分子内佐剂。考虑上述诸多方面,本研究课题设计肿瘤疫苗选择NY-ESO-1和bFGF双靶点疫苗,此外作为对照的是NY-ESO-1和bFGF单靶点疫苗。这三种疫苗中均含有分子内佐剂T细胞表位肽p4。目的(1)构建重组质粒并表达3种重组疫苗分子。(2)研究双靶点疫苗分子的抗肿瘤效果。方法(1)使用pET-32a质粒作为载体将目的序列构入其中共得到三种重组质粒,它们是pNb、pN和pb。pNb含有p4、NY-ESO-1和bFGF(10aa-150aa)。pN含有p4和NY-ESO-1。pb含有p4和bFGF。将三种质粒分别转入BL21(DE3),IPTG诱导并优化表达条件使目的蛋白得到良好表达。(2)将表达蛋白后的菌体经离心收集、重悬、超声裂解,再次离心分离上清和包涵体。将蛋白表达前菌体总蛋白、蛋白表达后总蛋白、上清蛋白和包涵体蛋白一并上样进行SDS-PAGE,随后考染并脱色。根据上述结果确定下一步纯化方法,使用的纯化方法有尿素变复性、镍柱纯化和离子柱纯化。(3)为建立黑色素瘤模型,选择C57BL/6小鼠作为实验动物并使用B16-F10作为实验用肿瘤细胞系。为使NY-ESO-1在B16-F10中稳定表达,使用慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro以及慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G。实验中将NY-ESO-1构建入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,随后将重组质粒与两慢病毒包装质粒一并转染入HEK293T细胞。HEK293T细胞上清经过滤得到到病毒颗粒,将病毒颗粒转染入B10-F10细胞即可。(4)动物实验将雌性C57BL/6分为6组,pNb组、pN组、pb组和AL(OH)组为免疫组,此外还有Tumor组以及Normal组。动物的疫苗免疫共有三次,完成后小鼠右背部皮下植入肿瘤细胞。(5)小鼠血清抗体使用ELISA法检测其滴度。小鼠的肿瘤使用游标卡尺测量并计算其大小。处死小鼠后肿瘤组织进行组织学实验。结果(1)成功构建含有目的基因的三种重组质粒,测序正确。(2)成功将重组分子在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,考马斯亮蓝染色及WB验证为目的蛋白。(3)完成可用于免疫动物的蛋白纯化,三种蛋白纯度均在90%以上。(4)在黑色素瘤模型中三种疫苗分子均具有抑制肿瘤生长的作用,双靶点疫苗pNb可能具有更好的肿瘤生长抑制。(5)血淋巴细胞流式细胞术检测可见,各疫苗组B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞均高于Tumor组,pNb组可能具有最高水平的上述淋巴细胞。结论成功表达的重组蛋白pN、pb、pNb免疫小鼠后有肯定的抗黑色素瘤效果。其中pNb可能具有优于pN、pb的抗黑色素瘤效果。