Nods样模式识别受体在变应性鼻炎患者鼻黏膜中的表达及意义

作     者：张沈华 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：文忠

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100213[医学-耳鼻咽喉科学] 10[医学] 

主      题：Nods 样模式识别受体 变应性鼻炎 变应原舌下脱敏 

摘      要：背景 变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是一种发病广泛、呈全球蔓延的鼻腔过敏性疾病,据文献报道发病率在10-20%之间,影响全球约30%成人和40%的儿童。它严重困扰着人们生活、学习和工作。其发病涉及环境及遗传两个方面,目前治疗主要为药物治疗为主。ARIA:将其定义为一种难于治愈但可以长期控制的疾病。因而有必要阐明发病机制,探寻新的治疗措施。其中感染因素对变态反应的影响存在争论。主要体现在“卫生假说提出的早期感染保护论及感染抑制变态反应。如Aaby[2]等报道了在法国儿童中,婴幼儿时期接种分枝杆菌能够阻止变态反应的发生,对和感染加重变态反应这两个方面。因此感染的影响成为该疾病的研究方向之一。 微生物刺激鼻黏膜引起机体启动天然免疫,第一步即识别,主要通过病原体本身的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)与黏膜细胞模式识别受体(Pattern Recognition Receptor, PRR)来实现,PRR是存在于细胞的种类繁多的受体蛋白家族,他们可以识别病原微生物(细菌、病毒等)标记或来自宿主本身的危险信号,进而触发免疫应答反应。研究表明,PRR参与了包括变态反应、自身免疫疾病及肿瘤等多种疾病的发病。PRR中研究较多的是Toll样受体,分布在细胞表面和特异的细胞器,如内吞型溶酶体[3],主要识别的是胞外微生物,其在识别细胞表面的致敏原进而在过敏反应中发挥重要作用,在这一领域已有较多研究。但一些微生物可以逃避细胞膜PRR,进入细胞内。如何识别此类病原体及胞内菌,引起研究者的不断探索。后来发现Nod样模式受体(Nod like receptors, NLRs)具有这种功能。近年来,这种新近发现但“古老,,的模式受体在包括过敏反应在内的上呼吸道炎症反应中的作用正受到重视。NLRs研究以Nod1、Nod2及Nalp3为主,对于Nod样受体家族在变应性鼻炎方面的作用目前文献报道较少。 NLRs可识别细胞质中的微生物成分。Nodl通过meso-DAP识别微小结构二肽,meso—DAP(二氨基庚二酸)是多数革兰氏阴性菌和一些革兰氏阳性菌的特征性成分。Nod2主要识别微小结构胞壁酰二肽(muramyldipeptide, MDP),是一种存在于所有革兰氏阳性和阴性菌胞壁内具有生物活性的最小肽聚糖模体。Nod1、Nod2识别各自配体后,激活Rip2(丝氨酸、苏氨酸激酶Rip2),进而激活促细胞分裂剂激活性蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF-kappaB),再进而促使前IL-1β的合成;Nalp3属于PYD亚家族分子,它能够识别细菌RNA、尿酸结晶物、ATP和某些细菌毒素.氢氧化铝(白矾)等。而Nalp1b和Cryopyrin/Nalp3(又名NLRP3)识别配体后,可促进炎症小(inflammasomes)的合成,进而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1,也称为IL-1p转换酶.),产生IL-1p的成熟分子或可促进细胞凋亡。 研究发现[5],国内变应性鼻炎主要的室内变应原是屋尘螨。机体是如何识别屋尘螨的变应原和相关成分?模式识别受体TLR发挥了重要的作用。如Der p1主要通过TLR2识别,LPS通过TLR4识别,与变应性鼻炎有关。但是TLR仅仅是分布于胞膜和胞内内涵体的受体,对于其他的病原体,如可逃避胞膜进入胞质的成分,TLR则不能识别,而NLR却可以识别。而屋尘螨的结构中恰恰存在这样的成分,主要在胞内识别。所以,研究NLR在屋尘螨引起的天然免疫的发病作用,显得十分关键。 Jacquet等[6]认为,HDM中可以检测出微生物组分,包括脂多糖LPS和b-葡聚糖类,这些成分似乎和HDM真正的抗原成分一样重要,通过模式识别受体的激活,引起Th2的极化。但是仅有佐剂成分能否激活天然免疫,却需要进一步研究。他着重说明强调,屋尘螨骨架蛋白包含壳多糖,并可以被表面模式识别受体TLR-2识别,产生促炎和前炎症介质。而另外的文献说明,佐剂壳聚糖(基于壳多糖的聚合糖),和二氧化硅、石棉,氢氧化铝一样,都能激活NLRP3(即NALP3),并且可以通过抗原提呈细胞进行信号转导。说明模式识别受体NALP3在屋尘螨变应原信号转导方面,可起到关键作用。壳多糖在屋尘螨引起的天然免疫中可发挥一定作用,但其中的机制需要进一步研究。 Hysi等[9]通过nod1基因多态性研究发现,Card4的变异和哮喘增高的易感性有关。细胞内模式识别受体nod1识别细菌特异性产物,影响了儿童哮喘的发病率。哮喘与变应性鼻炎“一个气道,一种疾病,故nod1基因多态性可能与变应性鼻炎发病有关。 因此,NLR对机体免疫功能有一定影响,对变应性鼻炎的发病有一定作用,可能体现在：1.感知微生物,介导炎症反应。2.激活后可以引起Th2细胞因子的释放,从而加重或维持变应性鼻炎炎症状态。3.感知佐剂,增强免疫应答。4.其基因多态性可能与变应性鼻炎发病有关。 本研究拟深入探讨NLR受体(Nod1、Nod2、Nalp3)在变应性鼻炎发病中的作用,现将实验结果报道如下。 目的 探讨Nods(核苷酸结合寡聚化结构域,Nod Like receptors)样模式识别受体(PRR)在变应性鼻炎患者下鼻甲黏膜组织中的表达及作用,并研究变应性鼻炎下鼻甲黏膜IL-4、IL-6、IL-10、IFN-r的表达情况,以鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜、鼻息肉做对照。提取变应性鼻炎外周血单个核细胞,比较变应性鼻炎患者脱敏治疗6个月前后单个核细胞Nod1表达的变化,及脱敏治疗前后血清、鼻分泌物中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ变化情况,探索Nodl表达变化和细胞因子变化之间的关系。 方法 2011年9月至2012年9月在南方医科大学珠江医院门诊变应性鼻炎(AR)患者,根据AIRA2010(依据临床表现、鼻腔检查情况、皮肤点刺实验结果或血清变应原特异性IgE检测)入组;对照组1：期间因鼻中隔偏曲行单纯鼻中隔偏曲矫正术患者;对照组2：慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP, chronic rhinosinusitis with nasal polyps)住院患者(根据EPOS2007指南标准纳入研究组)。本项研究得到了南方医科大学珠江医院伦理委员会的批准,且征得所有研究对象知情签字同意。 分别采用real-time RT-PCR、western-blot及免疫组织化学检测Nod1、od2、 NALP3mRNA及蛋白在变应性鼻炎患者下鼻甲黏膜(患者下鼻甲黏膜,以下简称黏膜)表达,以鼻中隔偏曲患者代偿侧下鼻甲黏膜、鼻息肉粘膜做对照。 ELISA测变应性鼻炎黏膜(组织匀浆液)IL-4、L-6、IL-10、 IFN-γ的表达量,以鼻中隔偏曲下鼻甲黏膜,鼻息肉组织做对照。 western-blot测变应性鼻炎患者舌下特异性免疫脱敏治疗6个月前后外周血单个核细胞Nod1的表达变化。 ELISA测变应性鼻炎患者脱敏治疗6个月前后血清、鼻腔分泌物IL-4、IL-6、 IL-10、IFN-γ表达变化。 结果 1.Real-Time RT-PCR显示：变应性鼻炎黏膜组织Nod1mRNA表达较正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉均低(P=0.31, P=0.00),NALP3mRNA表达较正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉均高(P=0.01,P=0.01),Nod2mRNA表达与正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉比较无明显差别,差异无统计学意义(P=0.06,P=0.10)。 2.western-blot结果提示：变应性鼻炎黏膜组织Nod1表达低于正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉组(均为P=0.00),NALP3高于正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉(均为P=0.00), Nod2三组之间差异无统计学意义(P=0.52,P=0.29)。 3.免疫组织化学表明,三种模式受体在三组中均有表达,主要表达于上皮细胞、腺体上皮、炎性细胞(如浆细胞、嗜酸性粒细胞),变应性鼻炎黏膜组织Nod1表达较正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉均低(P=0.01,P=0.00),NALP3表达较较正常对照下鼻甲粘膜、鼻息肉均高(P=0.01, P=0.01), Nod2蛋白表达三组之间差异无统计学意义(P=0.14)。 4.脱敏治疗前后,变应性鼻炎患者外周血单个核细胞均能检测出Nodl表达,治疗前(相对量1.06±0.13,)较正常对照组(0.29±0.05)相比,表达升高(P=0.00),治疗后表达量(0.34±0.15)降低,前后差异具有统计学意义(P=0.00)。 5.鼻粘膜IL-4.IL-6与Nodl呈正相关,分别为r=0.751,p=0.001, r=0.826,p=0.000,相关密切。变应性鼻炎黏膜IL-4、IL-6、IL-10与鼻中隔偏曲组差异无统计学意义(单位：pg/mg,15.22±1.17vs13.02±4.60,254.67±27.3vs206.00±62.56,20.25±2.75vs24.11±3.81,P=0.53,0.27,0.20),但均低于鼻息肉患者组(25.80±2.20,1133.09±312.08,51.10±17.22,P=0.00,0.00,0.01)。IFN-γ低于鼻中隔偏曲组(20.50±2.00vs28.19±7.63, P=0.04),与鼻息肉组相比(19.89±5.01,P=0.86),无统计学差异。 6.舌下脱敏治疗6月前后变应鼻炎血清细胞因子浓度分别：治疗前IL-6(8.25±0.93) pg/ml,治疗后(6.39±0.71) pg/ml,降低,P=0.00;治疗前IL-10(2.66±0.48) pg/ml,治疗后(4.78±0.44) pg/ml,升高,P=0.00;治疗前IFN-y (2.90±0.68)pg/ml,治疗后(9.82±0.85) pg/ml,升高(P=0.00)。鼻腔分泌物IL-4降低(P=0.01),IL-6、IL-10、IFN-γ两组无统计学差异(P=0.33,P=0.19,P=0.18)。 7.舌下脱敏治疗后,外周血单个核细胞Nodl表达改变与外周血IL-10的改变呈负相关,r=-0.884,p=0.002,相关密切。Nodl表达改变与IL-6的改变呈正相关,r=0.574,p=0.106. 结论 1. Nod1、Nod2及NALP3在三组组织中均有表达,变应性鼻炎组Nodl表达低于正常对照组、鼻息肉组,NALP3高于正常对照组、鼻息肉组。说明Nod1、NALP3有可能参与变应性鼻炎的发病。 2.变应性鼻炎外周血单个核细胞存在Nod1表达,且舌下脱敏治疗后,外周血单个核细胞Nod1表达降低,其表达降低与外周血IL-10的改变呈负相关,Nodl可能通过调控IL-10变化,参与舌下脱敏治疗。