水果中重点真菌毒素的高灵敏度光谱学检测技术研究

作     者：潘姝历 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马良

授予年度：2018年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083203[工学-农产品加工及贮藏工程] 

主      题：果品 真菌毒素 高灵敏 过氧草酸酯 靶标循环信号放大策略 

摘      要：近年来研究表明水果中存在的展青霉素(patulin,PAT)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)和链格孢霉毒素类(Alternaria toxins,ATX)等真菌毒素,具有直接或潜在的危害,成为真菌毒素研究的热点领域。由于鲜果中水分含量较高,果品中存在的真菌毒素也与污染粮油的真菌毒素差距较大,常规真菌毒素检测技术用于水果中真菌毒素检测时,准确度和灵敏度易受到影响甚至发生漏检,因此开发具有更高灵敏度和高特异性的真菌毒素检测技术十分重要。本研究旨在研究酶辅助的靶标循环策略和高效发光体系,提高两种方法在PAT、OTA和细交链格孢菌酮酸(Tenuazonic Acid,TA)中的检测灵敏度,构建基于以上增敏技术的适配体荧光传感器和化学发光免疫分析法,主要研究结果如下:(1)本研究采用酶促靶标循环信号放大策略提高PAT的检测灵敏度,并构建PAT适配体荧光传感器。研究显示,0.08 mg/mL的淬灭剂rGO-FeO可在5min内淬灭PAT适配体上标记的荧光,而PAT与适配体的特异性结合使荧光强度恢复,在荧光恢复阶段采用75U/mL DNA酶I对体系进行酶促靶标循环以实现信号放大,酶促反应1h,可最大限度地提升PAT的检测灵敏度。未采用信号放大策略的对照方法中,最低检出限(LOD)为3.61μg/L;采用酶促靶标循环对荧光信号进行放大,LOD为0.28μg/L,灵敏度(LOD)提高约13倍。基于此原理构建了PAT适配体荧光传感器,对PAT进行检测,在0.50μg/L范围内的线性相关系数R为0.9966。在实际样品加标回收实验中,PAT在苹果汁和葡萄汁中的平均加标回收率分别在77.34%6.65%、97.14%03.89%之间。与GB 5009.185-2016中HPLC的方法比对结果显示,本方法与国标方法无显著性差异。且该方法与AFB,DON,TA和T-2毒素均未见交叉反应,特异性较好。(2)本研究采用过氧草酸酯化学发光体系提高OTA检测灵敏度,并基于此建立间接竞争化学发光酶联免疫技术(icCLEIA)。通过研究,免疫反应阶段包被浓度1μg/mL,单抗稀释倍数10000倍,酶标二抗稀释倍数4000倍;在pH6.0下,浓度均为7.0×1033 mol/L过氧化脲和PHPPA进行酶反应10min,化学发光阶段TCPO乙腈溶液浓度为0.01 mol/L,此条件下该发光体系可最大限度地提升OTA的检测灵敏度。基于此构建了OTA的icCLEIA方法,该方法检测OTA的IC为554.60 ng/L,线性范围为48.94084.45 ng/L,LOD为14.69 ng/L。在加标回收实验中,OTA在葡萄干和葡萄汁中的平均加标回收率分别在84.55%1.36%、73.32%7.64%之间。该方法的平均批内和批间变异系数均小于10%,精密度较好。该方法与AFB、DON、T-2、PAT、ZEN和TA的交叉反应率均小于1%,特异性较好。将icCLEIA法与HPLC进行方法比对,两者的检测结果未见显著性差异。通过研究该方法的普适性,发现该法对水果及其制品、牛奶等极性样品中含羟基基团的真菌毒素检测效果较好,而不适用于非极性真菌毒素如AFB的检测。(3)本研究通过小鼠体内诱生法制备具有高特异性的抗TA单克隆抗体,采用过氧草酸酯化学发光体系与单抗结合提高TA化学发光免疫检测法的灵敏度。通过研究,免疫反应阶段包被浓度0.5μg/mL,单抗稀释倍数26000倍,酶标二抗稀释倍数6000倍,在pH6.0下,8.0×1033 mol/L过氧化脲和7.0×1033 mol/L PHPPA进行酶反应10min,化学发光阶段TCPO乙腈溶液浓度为5×1033 mol/L,此条件下该发光体系可最大限度地提升TA的检测灵敏度,且发现该化学发光体系在具有酮酸结构的真菌毒素检测中灵敏度提升效果更好。基于该发光免疫体系构建了TA的icCLEIA方法,该法检测TA的IC为95.2 ng/L,检测范围为12.20562.5 ng/L,LOD为2.53 ng/L。在加标回收实验中,实际样品的平均加标回收率在76.24%3.28%之间。该方法的平均批内变异系数为8.59%,批间变异系数为11.24%,与ZEN、OTA、AFB、DON、T-2、PAT、AOH、AME的交叉反应率均小于1%,特异性较好。与传统ELISA和鲁米诺icCLEIA进行方法比对,灵敏度(LOD)分别提高了约5倍和2倍。