利用电融合方法生产体细胞克隆小鼠

作     者：于洋 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郝艳红;李庆章;周琪

授予年度：2005年

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：电融合 小鼠 核移植 

摘      要：目前,生产体细胞克隆小鼠的常规方法是注射方法,只有1 篇文章报道用尾尖成纤维细胞与去除遗传物质的MⅡ期卵母细胞融合,成功生产体细胞克隆小鼠,但是克隆的效率远远没有达到人们预想的程度。 本实验主要研究电融合技术对于体细胞克隆小鼠生产的可行性和影响因素。采用新鲜的颗粒细胞直接注入到去除遗传物质的MⅡ期卵母细胞的透明带下,在1 次2.4kv/cm,20usec的直流电脉冲作用下,采用没有Ca融合液(0.3mol/L 甘露醇)诱导细胞融合。融合后的胚胎经过1 小时的培养,放置在含有10mmol/L Sr的激活液中活化6 小时。活化后的胚胎,一部分在体外培养3.5 天,观察囊胚发育率,并且移植到假孕2.5 天的代孕母鼠子宫中;另外一部分在体外培养到2-细胞期,移植到假孕0.5 天的代孕母鼠输卵管壶腹部中。19.5 天后,通过剖腹产获得体细胞克隆小鼠。对照实验采用注射的方法同样获得体细胞克隆小鼠。通过对电融合和注射方法获得的克隆胚胎对比,发现2 种克隆胚胎在活化率上没有显著差异(87.3% VS 90.3%,P0.05)。但是在卵裂率(82.4% VS 92.9%,P0.05)和囊胚率(47.3% VS 57.2%,P0.05)上,具有显著差异。实验还对影响融合效率的一些因素进行了研究,包括受体卵母细胞的老化﹑融合参数的改变﹑不同品系小鼠核移植﹑不同供体细胞核移植等影响因素对于电融合重构胚胎体外发育的影响。实验结果证明,目前使用的融和参数与融合条件都是合理并且可行的。 实验证明,两种核移植技术都能获得体细胞克隆小鼠。由于目前电融合技术已经成为克隆动物生产中的常规手段,因此从技术角度而言,电融合技术更便于广泛推广和使用。